离子色谱法测定肥料中微量 无机阴离子含量及国际标准制定研究*

储德韧，孙明星，刘 刚

(1.上海化工研究院有限公司/国家化肥质量监督检验中心〔上海〕 上海 200062； 2.上海出入境检验检疫局工业品与原材料检测技术中心 上海 200135)

针对上述问题，目前世界各国，特别是中国、美国、欧盟等都正积极开展相关领域测试方法和限值的研究[17]，我国于2012年发布了世界上首份关于化肥中阴离子快速测定方法的国家标准[18]。在欧盟，以法国为主要成员之一的欧盟CEN TC 260“肥料和石灰质材料”技术委员会第7工作组(WG 7)应欧盟委员会的要求，正在开展一项关于化肥中多种无机阴离子含量的离子色谱测试方法研究，其最终目的是通过相关法规与测试方法相结合，将欧盟境内化肥中相关无机阴离子的含量降至50 mg/kg以下。虽然上述进展令人振奋，然而时至今日，面对国内外各种新型肥料品种不断涌现的现实，在全球范围内针对肥料中无机阴离子含量的统一的测定国际方法标准仍然缺失，这不仅给全球肥料贸易带来不利影响，也不利于农业的可持续发展和生态环境的保护。

为了有效填补肥料中无机阴离子含量测定相关领域国际标准与规范的缺失，建立肥料中无机阴离子的辨识和控制体系，减轻对土壤、水源等环境的污染，达到保护环境、保证农作物正常生长和农产品安全、维护消费者健康等目的，同时也为肥料领域今后制定阴离子限量相关法规和建立我国主导的非关税贸易壁垒提供技术支撑，维护肥料用户的权益和规范全球肥料市场，上海化工研究院有限公司与上海出入境检验检疫局合作，在GB/T 29400—2012[18]的方法基础上进行了深入研究，于2015年12月向国际标准化组织ISO/TC134“肥料和土壤调理剂”标准化技术委员会申请了相关国际标准项目并获得立项。该研究项目开发了采用离子色谱法测定肥料中微量无机阴离子含量的新方法，即采用阴离子交换色谱柱并配合电导检测器，通过梯度洗脱或等度洗脱的策略，能有效地将肥料中6种常见阴离子与其他干扰物质分离并准确测定。经国际标准化组织ISO/TC134“肥料和土壤调理剂”标准化技术委员会推荐，由上海化工研究院有限公司牵头，会同上海出入境检验检疫局组织了国内外15家分析实验室针对一系列有代表性的肥料样品进行了国际实验室间比对活动。通过对各参与实验室提交的数据进行统计，结果表明该新方法的适用性广且精密度高，因此被推荐为新的国际标准ISO 20702[19]中所采用的标准方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Dionex ICS- 2100型离子色谱仪，配恒温电导检测器，AERS 500型阴离子抑制器，DionexTMIonPac AS18阴离子分析柱，Thermo Fisher Scientific Inc.；Metrohm 881型离子色谱仪，配电导检测器及抑制器，Metrosep A Supp 5阴离子分析柱，Metrohm China Ltd.；Millipore Simplicty超纯水机，Merck Millipore Co., Ltd.；SK2510HP超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；Mettler Toledo AL204- 1C型分析天平，Mettler Toledo Co., Ltd.；一次性注射器以及水相滤头(0.22 μm)，SPE- C18固相萃取小柱(1 mL)，钡离子固相萃取小柱(1 mL)，Ag/H固相萃取小柱(1 mL)，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 离子色谱条件

在国际标准草案文本ISO/FDIS 20702[19]及据此起草的国际实验室间比对作业指导书中，提供了2套离子色谱条件，分别采用梯度洗脱或等度洗脱策略，可供标准操作人员依据本实验室的具体条件进行选择。在国际实验室间比对作业指导书中，参与的实验室人员也被允许采用其他色谱条件(色谱柱)，只要其能够证明所采用的色谱条件(色谱柱)能够达到与本国际标准草案文本ISO/FDIS 20702[19]中所描述的同样的针对6种离子的分离效果，并在报告中备注其所采用的色谱条件(色谱柱)。

1.2.1 梯度洗脱色谱条件

采用DionexTMIonPac AS18阴离子分析柱(250 mm×4 mm)，柱温30 ℃；淋洗液为淋洗液发生器生成的高纯氢氧化钾溶液，淋洗液流速1.0 mL/min；采用自动再生抑制模式；电导检测器温度为35 ℃。进样量为25 μL，采用保留时间定性，峰面积定量。推荐的梯度淋洗程序设置如表1所示。

表1 推荐的梯度洗脱程序设置

时间/minOH-浓度/(mmol·L-1)0.001213.001214.008046.008047.001254.0012

1.2.2 等度洗脱色谱条件

Metrosep A Supp 5阴离子分析柱(250 mm×4 mm)，柱温40 ℃；淋洗液为配置的高纯碳酸钠-碳酸氢钠混合溶液并添加少量丙酮，淋洗液流速0.7 mL/min；电导检测器温度35 ℃。进样量20 μL，采用保留时间定性，峰面积定量。

1.3 试验方法

称取已经干燥、粉碎的肥料试样1 g(精确至0.000 2 g)于100 mL容量瓶中，以超纯水定容，摇匀后室温下超声浸提30 min，取部分上清液以4 000 r/min转速离心10 min。用注射器取离心所得上清液5 mL，缓缓推过0.22 μm水相微孔滤头后，再将试样溶液缓缓推入活化后的SPE- C18固相萃取小柱、钡离子固相萃取小柱及Ag/H固相萃取小柱(可选步骤，如果样品溶液需要净化)。弃去前2 mL溶液后所得的净化液在上述离子色谱条件下进行测定，同时在相同的条件下进行空白试验作为对照。

1.4 试验样品及参试机构

考虑到尽可能具有代表性，国际实验室间比对阶段使用的肥料样品种类包括磷酸一铵(样品A)、硝基复合肥(样品B)、氮磷钾(NPK)复混肥料(样品C)和硫酸钾(样品D)，4种样品中6种无机阴离子的浓度范围在10～1 700 mg/kg之间。

本次国际实验室间比对活动经国际标准化组织ISO/TC134“肥料和土壤调理剂”标准化技术委员会推荐，由上海化工研究院有限公司牵头，会同上海出入境检验检疫局召集了包括捷克国家参考物质实验室农业监督和测试中心、美国CF工业控股公司、国家精细化学品质量监督检验中心、湖南省产商品质量监督检验研究院、贵州省产品质量监督检验院、Metrohm中国有限公司、宁波出入境检验检疫局、美国印地安那州化学家办公室、泰州市产品质量监督检验中心、陕西省出入境检验检疫局、山东省产品质量检验研究院、上海化工研究院有限公司、上海出入境检验检疫局、Thermo Fisher科学公司、云南省化工产品质量监督检验站在内的全球15家分析实验室参与。

1.5 结果计算

(1)

V——试样/空白溶液的体积，mL；

m——试样质量，g。

取平行测定结果的算术平均值作为测定结果。

2 结果与讨论

2.1 标准色谱图分析

取6种无机阴离子的标准混合溶液，其中各离子的质量浓度均为20.0 mg/L，分别在标准草案文本[19]推荐的梯度洗脱色谱条件还是等度洗脱色谱条件下进行测定，所得的6种阴离子标准色谱图分别如图1和图2所示。

图1 梯度洗脱色谱条件下6种阴离子标准色谱图

图2 等度洗脱色谱条件下6种阴离子标准色谱图

由图1和图2可以看出，无论是标准草案文本[19]推荐的梯度洗脱色谱条件还是等度洗脱色谱条件，都能将6种阴离子及其他杂质在1 h内完成有效分离，这可为分离测定肥料中6种无机阴离子提供更多的选择。

2.2 比对试验数据统计研究

国际实验室间比对研究依据ISO关于国际标准项目制定相关程序[20]，按照国际标准草案文本ISO/FDIS 20702[19]及据此起草的国际实验室间比对作业指导书进行；比对试验数据依据ISO 5725- 2:1994《测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法》(以下简称ISO 5725- 2:1994第2部分)[21]进行统计分析。鉴于15家实验室对肥料中所有6种阴离子的测试数据进行统计分析的数据量非常庞大，且针对各种离子的测试结果数理统计步骤相类似，现以针对肥料中碘离子(I-)的测试结果统计为例对此过程展开说明。

2.2.1 原始数据及色谱条件

15家实验室之中的12家成功完成了编号为A～D的4种肥料样品中碘离子(I-)含量的测定，各实验室报告中所采用的色谱条件(色谱柱)及原始数据如表2所示。

表2 12家实验室测定4种肥料样品中碘离子(I-)含量采用的色谱条件(色谱柱)及原始数据

实验室编号i色谱柱肥料样品中碘离子(I-)含量水平j/(mg·kg-1)ABCD1AS-181 8501 844254.2265.6130.5132.971.5576.612AS-181 7441 759221.7247.4113.2121.957.2058.903Metrosep A Supp 51 6331 649270.2267.5134.2132.463.2163.934AS-191)1 6011 609208.8204.885.486.15AS-181 5251 536181.0180.0107.0105.06AS-181 8241 796230.1238.6118.0119.862.7663.507AS-181 7501 751219.7220.4121.8122.069.9569.958AS-181 7501 751219.6220.3121.9122.169.9969.959AS-181 6631 612240.0229.0135.7135.764.1870.9410Metrosep A Supp 71)1 6261 642212.8214.7121.4121.411AS-191)1 6031 709200.4277.299.8101.149.1549.0112AS-181 2191 310

注：1)实验室4、10和11未采用国际标准草案文本ISO/FDIS 20702[19]中所推荐的2种色谱柱

2.2.2 数据一致性和离群性检验

根据ISO 5725- 2:1994第2部分[21]，在对采用实验室间比对所得到的测定数据进行平均值和精密度参数计算之前，必须对数据的有效性(一致性)进行统计检验，剔除对结果可能造成干扰的离群值，确保数理统计结果的可靠性。

2.2.2.1 Mandel检验

首先采用Mandel的实验室间一致性统计量h和实验室内一致性统计量k来检验上述原始数据的一致性：对每个实验室(i)的每个水平(j)，计算实验室间的一致性统计量h和每个实验室内的一致性统计量k，以每个实验室的不同水平为一组进行描点作图，每组内的数据顺序按碘离子(I-)含量水平j从低到高为顺序排列，得到的Mandelh图和k图分别如图3和图4所示。

图3和图4中斜线填充的柱状数据表示该数据超过了显著性水平为5%时的Mandel统计量h与k的临界值，从而是歧离值；水平线填充的柱状数据表示该数据超过了显著性水平为1%时的Mandel统计量h与k的临界值，从而是离群值。

由图3可知：实验室4在样品C的测定中出现了歧离值，实验室5在样品B的测定中出现了歧离值，实验室11在样品D的测定中出现了歧离值；实验室12在样品A的测定中出现了离群值。由图4可知：实验室9在样品D的重复性测定结果有较大的变异，实验室12在样品A的重复性测定结果有较大的变异；实验室2在样品C的重复性测定结果有很大的变异，实验室11在样品A和B的重复性测定结果有很大的变异。根据Mandel统计图的结果，需要采用数值离群检验方法对上述原始数据进行进一步的统计分析。

图3 按12家实验室数据进行分组的Mandel实验室间一致性统计量h值

图4 按12家实验室数据进行分组的Mandel实验室内一致性统计量k值

2.2.2.2 Cochran检验

实验室间比对数据有效性的一项重要假设是各参与实验室所提交的数据的实验室内方差没有显著差异[22- 23]。根据ISO 5725- 2:1994第2部分[21]的要求，首先采用针对实验室内一致性的Cochran检验法[24]对各实验室的数据进行分析，计算得到的Cochran检验结果如表3所示。

表3 针对12家实验室测定的碘离子(I-)含量数据的首轮Cochran检验结果

项目 ABCDCochran统计量C1)0.4710.8530.8040.607歧离临界值(5%)0.541(p=12,n=2)0.570(p=11,n=2)0.570(p=11,n=2)0.680(p=8,n=2)离群临界值(1%)0.653(p=12,n=2)0.684(p=11,n=2)0.684(p=11,n=2)0.794(p=8,n=2)

注：1)如果计算所得Cochran统计量C大于置信水平5%临界值但小于等于置信水平1%临界值，则对应的被检验项目为歧离值；如果计算所得Cochran统计量C大于置信水平1%临界值，则对应的被检验项目为离群值

由表3可以发现，在2个碘离子含量水平(j)上(B和C)，Cochran统计量C的计算结果分别超出了其对应的显著水平为1%时的离群临界值，表明针对4个碘离子(I-)含量水平(j)的样品测试中，有的实验室数据不能用于进一步的统计分析，此结果与图4所得到的直观结果基本符合。经进一步分析原始数据，实验室11和实验室2分别在样品B和样品C的碘离子(I-)含量水平测定中所测得的数据绝对差异常大，这2个测定结果应当予以剔除。

经首轮Cochran统计检验剔除上述2个数据后，再次采用针对实验室内一致性的Cochran检验法[24]对各实验室剩余的数据进行分析，第2轮计算得到的Cochran检验结果如表4所示。

表4 针对12家实验室测定的碘离子(I-)含量数据的第2轮Cochran检验结果

项目ABCDCochran统计量C0.4710.6520.3080.607歧离临界值(5%)0.541(p=12,n=2)0.602(p=10,n=2)0.602(p=10,n=2)0.680(p=8,n=2)离群临界值(1%)0.653(p=12,n=2)0.718(p=10,n=2)0.718(p=10,n=2)0.794(p=8,n=2)

第2轮Cochran检验结果表明，舍弃2个离群数据之后，12家实验室剩余的数据在水平B和水平C的Cochran统计量C分别为0.652和0.308，均小于其对应的显著水平为1%时的离群临界值，表明此时的数据已经不存在方差有显著差异的离群值。

2.2.2.3 Grubbs检验

Grubbs检验是针对实验室间数据一致性进行的数理检验[25- 26]，此处检验的对象是通过Cochran检验后保留的数据。对12家实验室的数据进行计算得到的Grubbs检验结果如表5所示。

表5 针对12家实验室测定的碘离子(I-)含量数据的Grubbs检验结果

项目有效数据个数/个单侧低值单侧高值双侧低值双侧高值数据类型A122.5501.2390.737 50.248 8B101.8371.6300.417 30.417 3C102.0121.1320.708 20.708 2D81.9291.2140.664 60.664 6Grubbs统计量歧离临界值(5%)p=122.4122.4120.253 70.253 7p=102.2902.2900.186 40.186 4p=82.1262.1260.110 10.110 1Grubbs统计临界值离群临界值(1%)p=122.6362.6360.173 80.173 8p=102.4822.4820.115 00.115 0p=82.2742.2740.056 30.056 3

注：1)对于单侧离群值的Grubbs检验，如果计算所得Grubbs统计量G大于置信水平5%临界值为歧离值，大于置信水平1%临界值为离群值；

2)对于双侧离群值的Grubbs检验，如果计算所得Grubbs统计量G小于置信水平5%临界值为歧离值，小于置信水平1%临界值为离群值

2.2.3 平均值和标准差的计算分析

表6 12家实验室测定4种肥料中碘离子(I-)含量的平均值和标准差结果

项目ABCD有效实验室数据数目/个1211118剔除的离群值数目/个0110碘离子(I-)含量平均值x(水平)/(mg·kg-1)1 657227.3117.764.42重复性标准差Sr31.537.120.962.17再现性标准差SR155.3125.9715.898.10

上述结论是通过有12个实验室参与的一致性水平试验获得的，其中实验室11在样品B的碘离子(I-)含量水平测试中所测数据、实验室2在样品C的碘离子(I-)含量水平测试中所测数据经统计检验证明为离群值而被事先排除。

2.3 6种阴离子数据统计结果汇总

表7 6种阴离子含量平均值与对应的重复性限及再现性限之间的函数关系

阴离子重复性限r/(mg·kg-1)再现性限R/(mg·kg-1)F-10.4240.484x0.889Cl-0.015x+9.6850.137x+16.564Br-0.011x+1.3360.056x+29.554I-0.050x+2.3100.255x+11.595NO-20.339x0.88220.020SCN-0.140x0.8020.168x+11.155

注：1)重复性限r与重复性标准差Sr之间的函数关系采用r=2.8Sr；再现性限R与重复性标准差SR之间的函数关系采用R=2.8SR

2.4 参与比对活动的实验室反馈

通过全球15家实验室协作完成的国际实验室间比对活动，不仅考察了所研究开发的离子色谱方法的普适性及精密度，而且在试验过程中得到了一些参与实验室的宝贵反馈意见，对该国际标准方法的进一步规范化具有积极意义。

(2)实验室2观测到肥料样品A中的实测氟(F-)含量随前处理过程中的超声时间不同而有所差异。这可能是由于超声时间会影响样品中6种阴离子含量的测定结果，这也是在标准中规定统一超声时间为30 min的原因。

2.5 国际实验室间比对结果讨论

为确定国际标准草案文本ISO/FDIS 20702[19]中开发的离子色谱方法的适用性和精密度，对肥料样品中的6种阴离子含量开展了国际间实验室比对试验。在试验方案实施过程中，共征集到实验室15家，最终15家实验室提供了试验结果。

试验结果的精密度按ISO 5725- 2:1994第2部分[21]进行统计，发现有部分离群值，但没有离群实验室，所产生的离群值都是由随机误差所引起。精密度结果表明研究开发的肥料中6种微量无机阴离子含量的测定——离子色谱法是可行的，各实验室间的测定值有较好的一致性，经统计得到的精密度结果能用来确定试验方法的重复性限和再现性限。

3 结语

在国家标准《化肥中微量阴离子的测定 离子色谱法》(GB/T 29400—2012)的基础上，一种新的采用离子色谱方法测定肥料中6种微量无机阴离子含量的方法得以建立。新方法采用阴离子交换色谱柱，配合电导检测器，通过梯度洗脱或等度洗脱的策略，能有效地将肥料中6种常见阴离子与其他干扰物质分离并准确测定。经国际标准化组织ISO/TC134“肥料和土壤调理剂”标准化技术委员会推荐，由上海化工研究院有限公司牵头，会同上海出入境检验检疫局组织了国内外15家分析实验室针对一系列有代表性的肥料样品进行了国际实验室间比对活动，并针对各参与实验室提交的数据进行统计，结果表明该新方法的适用性广且精密度高，被推荐为新的国际标准中所采用的标准方法。