HPLC-MS/MS法测定2017-2018年淮安地区小龙虾中硝基呋喃类代谢物残留量
2018-09-12卜媛
吴 旭,卜媛 媛
(淮安市食品药品检验所,江苏 淮安 223300)
硝基呋喃类抗生素因具有抑菌性和杀菌性,曾广泛用于水产养殖中传染病的预防和治疗[1]。主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因四种,而其对应的代谢产物3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)、l-氨基-2-内酰脲(AHD)都能与蛋白质紧密结合,形成稳定的残留物,残留时间达数周以上,甚至在蒸煮、微波加热等情况下仍然无法降解。研究表明硝基呋喃类抗生素及其代谢产物对人体有潜在毒理性危害。欧盟将其列为A类禁用药物[2],且在2005年时又禁止在人类和动物中使用;美国在2002年将其禁用于食源性动物;日本也规定牛肉、猪肉、禽肉、虾肉都不得检出抗生素;我国农业部在2002年颁布禁令禁止将硝基呋喃类药物用在食源性动物身上。
江苏省淮安市盱眙县有着”中国龙虾之都”的美誉,自2001年至今,已举办了18界龙虾节。盱眙境内年产龙虾10万吨,年交易量15万吨,交易额突破60亿元。如今,盱眙80万人中有10万余人在龙虾产业链上淘金,龙虾已经成为盱眙县的支柱产业。
但是一些养殖场高密度饲养、养殖污水不处理等,导致疫病的爆发,为了预防和治疗病害,养殖户违法使用了硝基呋喃类抗生素。本研究通过对淮安地区小龙虾产品中,硝基呋喃类代谢产物的残留量检测,为该地区小龙虾中违禁药物使用情况进行调查,以促进小龙虾产业的健康发展,保障人民的食品安全。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
AOZ、SEM、AMOZ、AHD,农业部环境保护科研检测;D5-AMOZ,13C15N-SEM,13C3-AHD,D4-AOZ,北京曼哈格生物科技有限公司;2-硝基苯甲醛,纯度99%以上,Sigma公司;甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二甲亚砜等均为色谱纯,盐酸、K2HP04、NaOH等均为分析纯;水为Milli-Q制备的超纯水;pH精密试纸(4.5-10.0)。
API4000+超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪(沃特世公司),C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm,沃特世公司),XS205DU电子天平(METTLER TOLEDO公司)。
1.2 色谱条件
流速:0.2 mL/min;柱温:30℃,进样体积2 μL。流动相:A相0.1%甲酸水溶液;B乙腈,采用梯度洗脱,洗脱条件见表1。
表1 梯度洗脱条件
1.3 质谱条件
离子源:电喷雾电离源(ESI+);检测方式:多选择反应监测;CAD:4V;CUR:30 psi;GS1:50 psi;GS2:50 psi;雾化电压:5500 V;离子传输温度:500 ℃。的质谱条件见表2。
表2 质谱条件
2 样 品
2.1 样品来源
淮安地区各农贸市场和水产养殖厂抽样的小龙虾共计83批,覆盖淮安所有地区,采样时间为小龙虾生产季节(5~8月份),每批抽样小龙虾产品随机采集5份样品,每份样品1000 g。
2.2 取样方式
采样组织为虾头、虾壳和虾肉、清洗整虾和未清洗整虾。因小龙虾个体较小,每次用20只小龙虾组织,混合制样。
2.3 样品制备
提取:称取均匀试样(2g)于50 mL棕色具塞离心管中,加入10mL甲醇-水混合液(2+1),均质1 min,再用5 mL甲醇-水洗涤均质器刀头,二者合并4000 r/min离心5 min,吸取上清液弃掉。向每个样品管中加入混合内标溶液,使最终测定浓度均为2.0 ng/mL。
水解和衍生:向上述每个离心管中加入10 mL0.2 mol/L盐酸溶液均质1min,用10mL 0.2mol/L盐酸溶液洗涤均质器刀头,二者合并后加入0.3 mL0.0 5mol/L2-硝基苯甲醛溶液,用液体混匀器混匀,置恒温水浴振荡器中37℃避光振荡16 h。
净化:取出离心管冷却至室温,加人5mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液,用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.4,4000 r/min离心10min,上清液倒入下接Oasis HLB柱的贮液器中,使样液以<2 mL/min的流速通过Oasis HLB柱,待样液全部通过Oasis HLB柱后用10 mL水洗涤Oasis HLB柱,弃去流出液。用真空泵在65 kPa负压下抽干Oasis HLB柱15 min。用5 mL乙酸乙酯洗脱被测物于25 mL棕色离心管中,用氮吹仪在40℃水浴中吹干,用样品定容溶液溶解并定容至1.0 mL,过0.2 μm滤膜用液相色谱-串联质谱测定。同时做空白试验。
3 结果与讨论
3.1 结果比较
2017年淮安地区小龙虾产品40批,2018年43批,共计83批,结果见表3。在这两年中呋喃西林仍然存在违规用药情况,2017年检出率62%,2018年检出率63%,而呋喃唑酮、呋喃它酮和呋喃妥因均未有检出。
表3 2017~2018年淮安地区小龙虾产品中硝基呋喃类代谢物残留量检测结果
本方法中AOZ、AMOZ、SEM、AHD的检出限均为0.50µg/kg,四种代谢物加标回收率70%~106%,相对标准偏差RSD≤10%,符合国内外相关规定要求。
3.2 SEM问题
在检测中,很多样品都检测出了阳性的SEM,空白时SEM的检出率在10%以下,浓度在0.21µg/kg左右。
将小龙虾的虾头、虾壳和虾肉分别检验,发现在虾壳中SEM的含量最高,虾肉中SEM含量只是整虾的1/10,见图1。可见SEM检测结果和取样的组织部位有很大关系。
图1 小龙虾各部分中SEM含量
将同一批虾清洗和未清洗分别检验,发现未清洗的SEM含量是清洗过后的1.1倍,可见在养殖的水体[3]和池塘的底泥[4]中可能也含有呋喃西林,见表2。
表2 清洗与为清洗的小龙虾全虾中SEM的含量
4 结 论
本文采用HPLC-MS/MS法测定2017-2018年淮安地区小龙虾中硝基呋喃类代谢物的残留量。结果发现除了SEM外,其他代谢物都没有检出,说明四种硝基呋喃类药物中,之前在水产养殖中常用的呋喃唑酮已得到有效控制,但是呋喃西林的使用有增无减。而样品的取样部位对SEM的结果影响很大,处理样品时务必混合均匀,同步做好空白实验进行比较。同时也要注意SEM的假阳性问题,对于SEM是不是由小龙虾虾壳中自身产生,还有待进一步研究,所以SEM的定性也是检测的一大难点。简单的从SEM的测定结果上就判断使用了呋喃西林违禁药品,也有失公允。