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木犀草素对急性酒精性肝损伤的保护作用*

2018-09-11李小蓉赵忠孝刘靖丽

西部中医药 2018年6期
关键词:草素木犀匀浆

权 彦,李小蓉,赵忠孝,刘靖丽,张 朋

陕西中医药大学,陕西 咸阳 712046

急性酒精性肝损伤,即酒醉,是指因过度饮酒而引起的急性神经和躯体障碍[1],肝脏作为主要的解毒器官,过量饮酒将导致肝脏形态改变和功能紊乱[2]。此外,酒精对中枢神经系统具有一定的抑制作用,而中枢神经系统含有大量脂肪且过氧化氢酶活性较低,超氧化物歧化酶含量较低,这又容易引起自由基的过量产生从而损害机体健康[3-4]。木犀草素(3′,4′,5,7- 四羟基黄酮)是一种天然四羟基黄酮化合物,广泛存在于水果、蔬菜、中草药等天然植物中,如芹菜、西兰花、菊花、胡萝卜、胡椒、卷心菜、苹果皮和洋葱的叶子等[5-8]。木犀草素具有多种药理活性[9],随着对木犀草素研究的深入,发现它具抗炎、抗氧化以及对神经系统的保护作用[6,8,10-11]。因此,富含木犀草素的植物常常被用作中药治疗疾病。研究表明黄酮类化合物木犀草素,具有抗氧化性从而改善氧化应激引起的肝损伤和神经性损伤[12-14]。本文旨在讨论木犀草素(luteolin)对酒精所致小鼠急性肝损伤的保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 木犀草素(南京普怡生物科技有限公司,批号:150811);56%(V/V)红星二锅头白酒(北京红星股份有限公司,批号:150703);实验时,用蒸馏水配成所需浓度的混悬液;丙氨酸氨基转移酶(批号:20150423)、天冬氨酸氨基转移酶(批号:20150226)、甘油三酯(批号:20160112)和胆固醇(批号:20161102)、测定试剂盒及脂质过氧化物(批号:20161023)、超氧化物歧化酶(批号:20160304)测试盒均购自南京建成生物工程研究所;苏木精(批号:20160304)、伊红染料(批号:20160506)均购自上海生趁化工公司。

1.2 实验方法

1.2.1 防醉实验 6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠60只[西安交通大学医学部动物中心,动物合格证号:SYXK(陕)2015-013],自由进食饮水,自然昼夜采光,室温22~24℃,每日早晚喂食、换水。适应性喂养1周,随机分成5组,空白对照组、模型对照组、木犀草素低剂量组(25 mg/kg)、木犀草素中剂量组(50mg/kg)、木犀草素高剂量组(100mg/kg),每组12只。正常对照组和模型组给予同体积蒸馏水(灌胃)。每日称重,根据体质量调整用药量。连续灌胃(10天)。末次给药后,禁食16小时,模型组和各剂量组一次性予56%红星二锅头(0.016 mL/g)灌胃,进行翻正反射实验。实验期间,各组小鼠予普通饲料喂养,自由饮水,组间各因素无差异。将小鼠背向下轻轻放在鼠笼里,如果保持仰位姿势30秒以上,则认为小鼠翻正反射消失,记录小鼠给酒后到翻正反射消失时间以及小鼠翻正反射消失至恢复正常所需要的时间[16]。

1.2.2 急性酒精性肝损伤实验 6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠60只,自由进食饮水,自然昼夜采光,室温22~24℃,每日早晚喂食、换水。适应性喂养1周,随机分成5组,空白对照组、模型对照组、阳性对照组(联苯双酯150 mg/(kg·d)、木犀草素低剂量组(25mg/kg)、木犀草素中剂量组(50mg/kg)、木犀草素高剂量组(100 mg/kg),每组10只。每天给对应剂量木犀草素或联苯双酯1次,正常对照组和模型对照组给予等量蒸馏水;给药30分钟后,模型对照组和各给药组用56%(V/V)红星二锅头白酒灌胃,0.01 mL/g,每天1次,每天增加0.001 mL/g,直至增加到0.015 mL/g,保持至试验结束。连续灌胃10天,观察小鼠实验期间生理状态,并于实验始末分别记录各组小鼠体质量并计算脏器系数。

1.3 检测指标 末次灌胃后,禁食不禁水过夜,24小时后处死小鼠,摘眼球取血,分离血清。另于肝脏右叶取小块肝组织,4%多聚甲醛固定,酒精梯度脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片(厚度为4μm)备用,再用苏木素-伊红(HE)染色,通过倒置荧光显微镜在200×放大倍数下观察模型组和给药组的病理学形态。采血后取肝右叶约0.5 g,在低温条件下剪碎,放入匀浆器中,再加入9倍体积的冷生理盐水,研磨成匀浆后,离心取得肝匀浆液。按照试剂盒说明检测血清中AST、ALT、TG、TC含量,匀浆中MDA和SOD含量。

1.4 统计学方法 试验数据采用Excel进行整理,采用SPSS 20.0统计软件处理,计量资料以(±s)表示,采用 t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 木犀草素醒酒实验结果 在醒酒实验中,模型对照组和木犀草素各剂量给药组均出现酒后步态不稳等运动失调现象。小鼠翻正反射消失时间、小鼠翻正反射恢复时间,模型对照组与木犀草素各剂量组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 木犀草素对小鼠急性酒精性肝损伤实验结果

2.2.1 小鼠一般生理状态 空白对照组小鼠精神状态良好,皮毛光滑色泽鲜亮,活动及饮食正常,体质量明显增加;模型对照组小鼠精神萎靡不振,毛色粗糙、无光泽、发黄,饮食和活动明显减少且体质量增加缓慢,大便溏腻。木犀草素低、中、高剂量组及联苯双酯阳性对照组的小鼠精神活动良好,皮毛光滑有色泽,体质量虽有增加,但较正常组的小鼠体质量增加慢,状态好于模型组。

2.2.2 木犀草素对小鼠体质量、肝指数及血清AST和ALT的影响 小鼠体质量,模型对照组低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05);木犀草素各剂量组高于模型对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。肝指数,模型对照组高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05),木犀草素各剂量组低于模型对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。小鼠血清ALT、AST水平,模型对照组高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05);木犀草素高、中、低剂量组均低于模型对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2.3 木犀草素对急性酒精性肝损伤小鼠血清TC、TG水平及匀浆中SOD、MDA含量的影响 与模型对照组比较,木犀草素各剂量组均可以有效降低小鼠急性酒精性肝损伤中血清TC和TG水平和肝匀浆中MDA含量,同时增加SOD活性,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.2.4 木犀草素对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏病理变化分析 空白对照组、阳性药和木犀草素高剂量组肝脏均无明显的病理变化,肝细胞基本完整,肝小叶清晰,肝索以中央静脉为中心呈放射状整齐排列(图1A),模型组肝脏细胞间隙有轻度淤血,肝细胞排列紊乱,可见炎性细胞浸润,且有细小脂滴堆积(图1B)阳性药细胞结构接近完整(图1C)木犀草素高、中、低剂量组肝细胞脂肪变性程度依次减轻,炎细胞浸润和点状坏死明显减少。图1D,1E,1F结果表明,木犀草素高、中、低剂量组可不同程度抑制肝脏脂肪变性,缓解肝损伤。见图1。

表1 木犀草素对醉酒小鼠翻正反射的影响(±s)

表1 木犀草素对醉酒小鼠翻正反射的影响(±s)

注:*表示与模型对照组相比,P<0.05

组别 只数 剂量/(mg·kg-1) 翻正反射消失时间/min 翻正反射恢复时间/min模型对照组 12 - 19.3±1.2 323.5±15.7木犀草素高剂量组 12 100 32.2±1.8* 238.3±27.3*木犀草素中剂量组 12 50 28.3±2.7* 264.2±23.5*木犀草素低剂量组 12 25 20.4±2.5* 308.7±20.1*

表2 木犀草素对急性酒精性肝损伤小鼠体质量和肝指数的影响(±s)

表2 木犀草素对急性酒精性肝损伤小鼠体质量和肝指数的影响(±s)

注:#表示与对照组比较,P<0.05;与模型对照组比较,*表示P<0.05,**表示P<0.01

组别 只数 体质量/g 肝脏指数/% AST/(IU·L-1) ALT/(IU·L-1)空白对照组 10 35.3±1.7 6.2±0.3 137.5±5.9 32.4±4.3模型对照组 10 24.2±1.9# 7.3±0.7# 310.5±43.7# 223.5±15.7#联苯双酯组 10 29.7±1.3* 6.5±0.4* 213.3±23.8* 143.7±28.3*木犀草素高剂量组 10 28.8±1.8* 6.1±0.9* 194.2±23.5* 154.6±20.1*木犀草素中剂量组 10 27.3±2.1 6.3±0.8* 284.6±27.3* 185.5±11.9**木犀草素低剂量组 10 25.4±1.5* 7.0±0.2** 304.5±21.7** 194.2±19.4**

表3 木犀草素对急性酒精性肝损伤小鼠血清TC、TG和匀浆中SO D及M D A含量影响(±s)

表3 木犀草素对急性酒精性肝损伤小鼠血清TC、TG和匀浆中SO D及M D A含量影响(±s)

注:#表示与空白对照组相比P<0.01,**表示与模型组比较P<0.01

分组 只数 TC/(nmol·L-1) TG/(mmol·L-1) MDA/(nmol·L-1) SOD/(U·mg-1)t值 p值 t值 p值 t值 p值 t值 p值对照组 10 / / / / / / / /模型组 10 -4.60 <0.01 -5.71 <0.01 -6.43 <0.01 12.40 <0.01联苯双酯组 10 -4.79 <0.01 -6.05 <0.01 -6.05 <0.01 11.90 <0.01木犀草素高剂量组 10 -4.55 <0.01 -7.38<0.01 -6.40 <0.01 9.35 <0.01木犀草素中剂量组 10 -4.31 <0.01 -4.79 <0.01 -5.12 <0.01 7.75 <0.01木犀草素低剂量组 10 0.79 / -3.01 <0.01 -4.90 <0.01 6.00 <0.01

图1 木犀草素对小鼠急性酒精性肝损伤的肝组织病理学影响(HE×200)

3 讨论

在我国,酒精所致的肝损伤是继病毒性肝炎外的第二大肝病。肝脏作为主要的解毒器官,在短期大量饮酒后,会造成肝损伤。酒精性肝病的临床表现分为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化和酒精性肝细胞癌症。应用中药提取物治疗酒精性肝损伤,既可以为民族医学的发展带来契机,又可以减少西药的不良反应。本实验通过建立醉酒模型考察木犀草素醒酒作用,与模型对照组比较,木犀草素各剂量组可以不同程度延长小鼠翻正反射消失时间,缩短翻正反射恢复时间从而改善小鼠的醉酒状态。同时建立急性酒精性肝损伤模型,与模型对照组比较,木犀草素显著降低血清中AST、ALT、TC和TG水平,增加匀浆中SOD含量,降低匀浆中MDA含量,说明木犀草素具有抗氧化活性。此外,通过HE染色考察病理组织学改变情况,发现木犀草素可以减轻肝细胞脂肪变性,减少炎性细胞浸润和点状坏死。近年来,关于木樨草素的研究已涉及多方面,其中木犀草素能明显改善四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化[14],还可以改善HO-1诱导的急性胰腺炎。关于木犀草素对酒精肝作用研究较少,而抗酒精性肝损伤的药物缺乏有效性,研究表明木犀草素具有醒酒的作用且对酒精性肝损伤具有一定的保护作用,关于其抗酒精性肝损伤的进一步机制还有待研究。

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