核仁蛋白RRP15在细胞有丝分裂期的表达与定位

陈超敏 ，杨 佳 ，董智雄 ，3，朱长军 ，3

（1.天津师范大学 生命科学学院，天津 300387；2.天津师范大学 天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387；3.天津师范大学 分子细胞系统生物学重点实验室，天津 300387）

细胞增殖过程又称为细胞周期，是细胞生命活动的重要特征之一.细胞周期是从一次细胞分裂结束开始，经过物质准备，直到下一次细胞分裂结束为止.细胞周期分为DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和有丝分裂期（M期）[1-3].细胞有丝分裂期又可分为前期、前中期、中期、后期和末期.细胞周期是一个十分复杂而又精确的生命过程，多种蛋白参与细胞周期的精确调控，使其能够正确运行，而任何环节的异常都可能导致细胞死亡或细胞周期调控紊乱，最终引起细胞恶性增殖和肿瘤[4-6].核仁（nucleolus）是真核细胞内无定型的亚细胞器结构[7-8]，是细胞内核糖体生物发生的场所[9-10].核糖体是细胞内蛋白翻译的唯一细胞器，因此核仁的结构与功能与细胞增殖密切相关[11].近年来大量研究表明，核仁及核糖体相关蛋白在细胞应激反应过程中发挥着重要作用，在多种内外条件的刺激下（如营养缺乏、DNA损伤和活性氧自由基ROS的积累），细胞产生应激反应，导致核糖体发生生物学变化[12-13]，即产生核糖体压力.核糖体压力应答通路参与维持细胞的稳态和基因组稳定[14-16]，该应答通路的异常，包括参与其中的各种蛋白质结构、定位及功能的异常，都将引起细胞增殖和功能异常，最终导致多种疾病特别是肿瘤的发生与发展[14，17].

核糖体RNA加工蛋白15（ribosome RNA processing protein 15，RRP15）是一个在进化中高度保守的蛋白质，其蛋白结构中部含有一个coiled-coil结构域，N端和C端没有特异结构域.据报道，在酵母中，RRP15参与核糖体60S大亚基的生物发生[18]；在小鼠中，RRP15可以调节细胞增殖和细胞凋亡，并在核糖体RNA加工中发挥重要作用[19].本课题组前期研究发现，RRP15蛋白在细胞周期有丝分裂间期定位于核仁，并且在保持核仁结构完整、核糖体生物发生以及细胞增殖等细胞生命活动中发挥重要调控作用[17，19]，但RRP15在有丝分裂期的功能仍不清楚.已知在细胞有丝分裂前期核仁发生解体，RRP15的亚细胞定位必然发生变化.RRP15蛋白在细胞周期不同时期的表达、亚细胞定位及其具体功能尚未见报道.

本研究以能够稳定表达GFP-RRP15的HeLa细胞为材料，通过细胞同步化、蛋白免疫印迹、免疫荧光染色、活细胞成像和染色体提取等方法，研究了RRP15在细胞周期不同时期的表达情况、亚细胞定位及其与有丝分裂期细胞染色体的关系，希望能够为进一步研究RRP15蛋白在细胞有丝分裂期的功能、探讨RRP15与肿瘤发生发展的关系以及将RRP15作为肿瘤治疗的潜在靶点提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

人宫颈癌细胞株HeLa、pEGFP-RRP15质粒为天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室所有[17].

1.1.2 试剂

DMEM培养基，美国Gibco公司；胎牛血清，美国Hyclone公司；Lipofectamine 3000、荧光标记或辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗和DAPI，美国Invitrogen公司；特异性单克隆鼠抗α-Tubulin抗体、GFP抗体，美国 Sigma公司；RNA 酶（RNase）、DNA 酶（DNase），美国Takara公司；新霉素（G418），德国Calbiochem公司；特异性多克隆兔抗RRP15抗体、特异性多克隆兔抗PRC1抗体，本课题组自制.

1.1.3 仪器

蛋白电泳仪，美国Bio-Rad公司；Nikon TS-100 FL倒置荧光显微镜和Nikon 90i共聚焦荧光显微镜，日本Nikon公司.

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及传代

HeLa细胞用含有10%（体积分数）胎牛血清的DMEM培养基在细胞培养箱中（温度为37℃，CO2体积分数为5%）培养，每周传代2～3次，传代时先用胰酶消化细胞，扩增细胞至新鲜培养基中.

1.2.2 细胞同步化实验

采用双胸腺嘧啶核苷（double-thymidine）阻滞法将HeLa细胞阻滞于G1/S期.在对数生长期的HeLa细胞中加入终浓度为2 mmol/L的胸腺嘧啶核苷（thymidine），培养16～18 h.将细胞释放至新鲜培养基中培养12 h，然后再次加入终浓度为2 mmol/L的胸腺嘧啶核苷，继续培养12 h.最后释放细胞至新鲜培养基中，每隔2 h收集一次细胞，直至24 h.将收集的细胞用体积分数为70%的冰乙醇溶液固定或裂解后保存在-20℃冰箱内，分别通过流式细胞术和蛋白印迹杂交法进行检测分析.

1.2.3 流式细胞术

将同步化收集固定的细胞离心去除乙醇，用PBS洗涤 2次.加入 0.5 mL 的碘化丙啶（PI）染色液（50 μg/mL PI+100 mg/L RNase），37℃下避光放置30 min.应用Facsort流式细胞仪对细胞内的DNA含量进行检测，使用CellQuest软件分析细胞周期的分布状况.

1.2.4 蛋白免疫印迹杂交（Western blot）

收集细胞，使用1×SDS蛋白上样缓冲液进行裂解.将细胞裂解液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，其后转膜至PVDF膜.用含有脱脂奶粉（质量分数为5%）的TBS缓冲液室温封闭30 min，随后经室温一抗孵育2 h，二抗孵育1 h，最后加ECL显色液，在暗室内曝光检测PVDF膜上的蛋白.

1.2.5 细胞免疫荧光（immunofluorescence，IF）

在细胞爬片上培养HeLa细胞，取出爬片后PBS洗3次，用500 μL的福尔马林固定液固定细胞15 min，用含有甘氨酸（浓度为0.1 mol/L）的PBS终止固定反应.加入封闭液室温封闭30 min，弃去封闭液，用含有Triton X-100（质量分数为0.1%）的PBS洗3次.随后加一抗室温孵育2 h，荧光标记的二抗室温避光孵育1h，加1μg/mL的DAPI染色3min.最后封片，镜检.

1.2.6 细胞转染

在24孔板中接种5×104个HeLa细胞，CO2培养箱中培养24 h.按照产品说明书，应用Lipofectamine 3000转染试剂将质粒pEGFP-RRP15转入细胞中，继续培养24 h，荧光显微镜下观察转染效率.

1.2.7 G418筛选

细胞转染24 h后，用胰酶进行消化，收集细胞计数.转1 000个细胞至直径为10 cm的细胞培养皿中，每皿加入含有G418（质量浓度为1 g/L）的DMEM培养基，每5 d更换新鲜的含G418的DMEM培养基继续培养.10 d后在倒置荧光显微镜下挑取荧光细胞克隆，置于24孔板中，待细胞生长扩增后转入直径为10 cm的培养皿中继续培养.

1.2.8 活细胞成像实验（living cell imaging）

将稳定表达GFP-RRP15的细胞接种于玻璃底细胞培养皿中，在活细胞成像系统中进行培养.应用荧光显微镜观察记录细胞内荧光蛋白的变化，每2 min拍照一次，连续拍摄24 h.

1.2.9 染色体提取实验（chromosome spreading）

在含有秋水仙素（质量浓度为0.1 μg/mL）的DMEM中培养HeLa细胞18 h，收集培养皿中悬浮的有丝分裂期细胞，置于冰上.用冰冷的PBS洗3次，再次离心收集.加入含有KCl（浓度为60 mmol/L）的PBS，37℃下放置30 min，短暂离心.应用固定缓冲液（甲醇和乙酸的体积比为3∶1）将细胞冰上固定15 min，短暂离心.用2 mL固定buffer重悬细胞，从高处将细胞滴到载玻片上，随后将细胞在含有DNase I（1 U/μL）的PBS中37℃下孵育20 min，对照组不含DNaseI.再用含有RNase（质量浓度为100μg/mL）的PBS在37℃下孵育20 min.用PBS洗3次，每次5 min.随后室温一抗孵育2 h，二抗避光孵育1 h，质量浓度为1 μg/mL的DAPI染色3 min.在载玻片上滴加4 μL的抗淬灭剂，封片，镜检.

2 结果与分析

2.1 RRP15在细胞周期不同时期的表达

采用Double-thymidine阻滞法对HeLa细胞进行同步化处理，在不同时间收集细胞后，用流式细胞术分析细胞周期分布状况，用Western blot检测RRP15在细胞周期不同时期的表达水平，结果如图1所示.

图1（a）中的流式细胞术分析结果表明，HeLa细胞同步化较好，在0 h所有细胞均集中在G1/S期，其后随着释放时间的推移，进入HS期，并在6～8 h时进入G2/M期，在10 h重新进入G1期.由图1（b）可以看出，PRC1（protein regulate cytokinesis 1）蛋白主要在6～8 h的细胞中表达，该蛋白是一个参与调控细胞有丝分裂及胞质分裂的微管结合蛋白，在G2/M期高表达.RRP15蛋白在细胞周期的不同时期均有表达，且在10～24 h的细胞中表达微量上调.

图1 RRP15在细胞周期不同时期的表达Fig.1 Expression of RRP15 during cell cycle

2.2 RRP15在细胞有丝分裂期的亚细胞定位

RRP15在整个细胞周期中均有表达，预示它在细胞周期的各个时期都发挥着不可或缺的功能.利用纯化的RRP15抗体对细胞进行免疫荧光染色实验，结果如图2（a）所示.为了进一步直观观察RRP15在细胞生长周期不同时期的定位，进行活细胞成像实验，结果如图2（b）所示.

由图2（a）可以看出：RRP15在间期细胞中主要定位于核仁；在核基质和细胞质中也有少量定位.而在有丝分裂期，RRP15的细胞定位始终伴随着染色体的行为而变化：前期核膜尚未破裂，RRP15仍主要定位于核仁部位；进入前中期后，核膜破裂，核仁消失，RRP15散布在整个细胞中，并在染色体周围定位较多；中期RRP15随着染色体排列而集中在赤道板附近；后期RRP15仍集中在染色体附近；在末期，RRP15出现多个点状集中区域（蓝箭头所示），可能为重新组装的核仁结构；当核膜形成，核仁重新出现时，RRP15重新定位于核仁中.除此之外，RRP15在有丝分裂末期的中小体结构处也观察到少量定位（黄箭头所示）.由图2（b）可以看出：GFP-RRP15在有丝分裂间期也主要定位于核仁部位，这与内源性染色结果一致；而在有丝分裂期，GFP-RRP15始终伴随着染色体；在末期，除主要定位于重新装配的核仁部位外，在中小体部位也存在少量GFP-RRP15定位（红箭头所示）.总的来看，RRP15在有丝分裂期是一个染色体伴侣蛋白，始终伴随染色体定位.

图2 RRP15在细胞有丝分裂期的亚细胞定位Fig.2 RRP15 subcellular localization in mitosis

2.3 RRP15与染色体的关系

细胞免疫荧光染色实验和活细胞成像实验显示，RRP15在有丝分裂期伴随在染色体外周.为了进一步确认RRP15与染色体的关系，利用染色体提取制备方法分离有丝分裂中期细胞的染色体，并通过免疫荧光观察RRP15与染色体的关系，结果如图3（a）所示.将纯化的染色体经RRP15抗体和DAPI染色，发现RRP15与DNA存在明显的共定位，由此证实RRP15定位于分离的有丝分裂期染色体上.RRP15可能通过与DNA直接作用结合在染色体上，也可以通过与染色体上其他蛋白的相互作用定位至染色体.为了进一步分析RRP15的染色体定位机制，再次进行了染色体提前制备实验，并对实验操作步骤做了修改.将染色体从细胞中分离到载玻片上后，首先用DNase处理消化DNA，然后再进行固定，染色.通过免疫荧光染色实验检测DNase处理后RRP15蛋白定位的变化.如果RRP15为DNA结合蛋白，则消化DNA后RRP15也将从染色体上脱落，无法观察到RRP15的染色；若RRP15为染色体外周蛋白，消化DNA则不会影响RRP15的定位，最后仍可观察到RRP15染色.实验结果如图 3（b）所示.由图 3（b）可以看出，DNase处理引起染色体DNA的染色明显下降，但RRP15的染色体外周染色并没有显著变化.这表明RRP15在有丝分裂期定位于染色体但不依赖于染色体DNA，而是通过其他机制定位于染色体外周.

图3 RRP15与染色体的关系Fig.3 Relationship of RRP15 with chromosome

3 讨论与分析

核糖体RNA加工蛋白RRP15已被证实是核仁定位蛋白，与核仁的形成、核糖体的生物发生以及细胞生长增殖密切相关[17].本研究明确了RRP15在细胞周期不同时期的表达情况和亚细胞定位，证实RRP15在整个细胞周期中均有稳定表达，且在G1期表达微量上调.RRP15在细胞有丝分裂间期的定位与功能研究已经较为明确.前期研究[17]表明，RRP15在间期定位于核仁，并且在控制核仁形成、核糖体生物发生和细胞增殖方面发挥重要的调控作用，但是RRP15在有丝分裂期的定位与功能仍然是未知的.本研究通过细胞免疫荧光染色、活细胞成像技术及有丝分裂中期染色体提取染色等实验确定了在有丝分裂期RRP15的定位伴随着染色体，并且在有丝分裂末期有少量定位于中小体部位.RRP15在有丝分裂期是一个染色体外周蛋白，其染色体外周定位不依赖于染色体DNA.这一结果表明，RRP15在有丝分裂期作为染色体外周蛋白，可能发挥着保护和维持细胞有丝分裂期染色体结构的功能，在有丝分裂期细胞染色体的整列与分离过程中发挥潜在作用，最终参与调控细胞基因组的稳定性[20-21].

综上所述，本研究结果为探讨RRP15在细胞有丝分裂期的功能提供了细胞表型基础，并为探究染色体外周蛋白的定位提供了新的技术方法.在后续研究中，本课题组会进一步探讨将细胞内RRP15过表达或敲除后有丝分裂期染色体整列与分离以及有丝分裂纺锤体形成与功能的异常等，最终明确RRP15在细胞有丝分裂期的具体作用.