血浆SEPT9基因甲基化监测结直肠癌术后复发转移的应用价值

张姗 房春芳 丁洁 付波 陈双峰 焉鹏

结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率逐年升高。手术是目前治疗结直肠癌的主要手段，但是30%～50%结直肠癌患者在根治术后出现复发或转移，这成为结直肠癌患者的主要死亡原因。血清CEA水平是临床用于患者术后监测的生物学标志物，但因敏感度和特异性低而限制其在结直肠癌早期诊断及复发转移监测中的应用［1］。DNA甲基化是肿瘤发生发展过程中的早期事件，近期国内外研究表明血浆SEPT9基因甲基化（mSEPT9）检测在结直肠癌患者中均有较高的敏感度和特异性［2−8］，有望成为临床诊断结直肠癌最有价值的分子标志物。但其在结直肠癌术后随访监测中的应用前景尚未明确。本研究通过检测结直肠癌患者根治术后血清CEA水平和血浆mSEPT9状态，探讨血浆mSEPT9作为监测结直肠癌术后复发转移标志物的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 病例资料

回顾性分析2013年2月至2015年1月聊城市人民医院经病理组织学确诊、行根治性手术治疗的214例Ⅰ～Ⅲ期原发性结直肠癌患者临床资料，其中男性118例，平均年龄（63.24±11.35）岁；女性96例，平均年龄（63.77±9.35）岁。病理学分期采用美国癌症联合会/国际抗癌联盟（AJCC/UICC）结直肠癌TNM分级系统（2009年第7版）。所有患者术前无远处转移病灶。本研究经聊城市人民医院伦理委员会审核批准（批号：2016031），患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本收集及血清（浆）样本制备 留取结直肠癌患者术前及根治术后空腹外周血，其中2 mL置促凝管内，2 000 r/min离心10 min分离血清，用于检测血清CEA水平；10 mL置Vacutainer®K2EDTA抗凝真空采血管（英国BD−Plymouth公司）内，离心自然停止，（2 500±500）r/min离心12 min。取出采血管，将血浆转移到15 mL离心管中，再次离心，将离心后的血浆3.5 mL转移至新的离心管中。血浆样本保存于−80℃冰箱用于mSEPT9检测。

1.2.2 游离核酸提取及亚硫酸盐转化 利用Epipro Colon Plasma Quick Kit试剂盒（德国Epigenomics AG公司）采用磁珠法提取血浆游离DNA，经裂解、洗涤、洗脱等步骤获得约100µL游离DNA。洗脱液加入150µL亚硫酸盐溶液和25µL保护液80℃恒温孵育45 min。加入磁珠结合后，3次洗涤磁珠，室温干燥后加入60µL洗脱液，23℃下洗脱亚硫酸盐转化的DNA。

1.2.3 实时荧光探针PCR检测mSEPT9状态 采用Epi proColon 2.0试剂盒（德国Epigenomics AG公司）在ABI7500 PCR仪（美国Applied Biosystems公司）上进行血浆mSEPT9 V2区检测，反应体系为15µL PCR预反应液加入15µL经亚硫酸盐转化的DNA样本，进行3重平行PCR测试。PCR扩增条件：94℃预变性20 min；93℃变性30 s，62℃退火5 s，55.5℃延伸35 s，45个循环。结果判读：依据试剂盒说明书，测试样本内参基因β−actin的Ct值≤32.1结果为判定有效，试剂盒提供的阳性和阴性对照作为质控品。3重平行测试中，2重及以上mSEPT9的Ct值＜45结果判定为阳性，反之为阴性。

1.2.4 血清CEA水平检测 应用电化学发光法，采用CEA检测试剂盒（德国Roche公司）在Elecsys 2010分析仪（德国Roche公司）上进行CEA浓度测定。依据试剂盒说明书，CEA浓度≥5 ng/mL为阳性。

1.2.5 随访 患者术后随访3年，第1年每3个月随访检查1次，后2年每6个月1次，定期复查结肠镜、胸腹部CT、检测血清CEA水平和血浆mSEPT9状态等。如术后3年内死亡即结束随访。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。连续变量以x±s表示，率的比较采用χ2或Fisher精确检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌患者术前临床病理特征与血浆mSEPT9和血清CEA的关系

214例患者术前150例血浆mSEPT9检测阳性，阳性率为70.1%（150/214），阳性率随TNM分期而增高，Ⅰ期为46.2%（24/52）、Ⅱ期为66.7%（76/114）、Ⅲ期为83.8%（62/74），差异具有统计学意义（P=0.027），血浆mSEPT9与患者年龄和性别之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；术前血清CEA浓度与结直肠癌患者的年龄、性别及TNM分期之间比较差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 结直肠癌患者术前临床病理特征与血浆mSEPT9和血清CEA的关系

2.2 结直肠癌患者手术前后血浆mSEPT9及血清CEA变化

结直肠癌根治术后，18例患者血浆mSEPT9检测为阳性，阳性率为8.4%，与术前（阳性率70.1%）相比差异具有统计学意义（P＜0.001，图1A）。术后CEA浓度为（1.44±1.68）ng/mL，与术前（5.34±10.19）ng/mL相比差异具有统计学意义（P＜0.001，图1B）。术后mSEPT9阳性率与临床病理分期之间差异无统计学意义（P=0.566，图1C）。

2.3 结直肠癌患者术后复发、转移患者血浆mSEPT9阳性率与血清CEA阳性率的比较

214例患者术后随访3年中，结直肠癌复发或远处转移患者64例，其中肝转移22例、局部复发9例、肺转移11例、骨转移7例、淋巴结转移3例、多器官转移12例。回顾性分析64例复发转移患者的术前与术后血浆mSEPT9阳性率发现差异具有统计学意义（81.3%vs.21.9%，P＜0.001，图1D）。在64例患者随访过程中，血浆mSEPT9检测阳性为50例，阳性率为78.1%，血清CEA检测阳性26例，阳性率为40.6%，两者比较差异具有统计学意义（P＜0.001）。术后随访发现5例mSEPT9持续阳性患者中4例1年内复发转移。图2所示为典型病例监测结果。

图1 血浆mSEPT9在结直肠癌根治术疗效评价中的应用价值

2.4 血浆mSEPT9联合血清CEA检测对结直肠癌复发转移的诊断效力

在64例结直肠癌复发或远处转移患者中，血浆mSEPT9联合血清CEA检测阳性为54例，阳性率为84.4%。两者联合检测诊断结直肠癌术后复发转移的ROC曲线见图3。mSEPT9联合CEA检测ROC曲线下面积（AUC）值为0.960，两者联合检测诊断复发转移的敏感度和特异性分别为84.4%和94.4%。

图2 血浆mSEPT9和血清CEA监测结直肠癌复发典型病例结果

图3 血浆mSEPT9与血清CEA联合检测结直肠癌复发转移ROC曲线

3 讨论

目前研究证实结直肠癌的发生、发展与基因突变及表观遗传学改变有关［9−10］，结直肠癌患者肿瘤组织、血液和粪便中均可检测到相关基因的甲基化改变［11］。SEPT9 基因位于17q25.3，编码 SEPT9蛋白，SEPT9蛋白属于GTP结合蛋白，其生物学功能主要是参与细胞质分裂和细胞骨架结构形成［12］。SEPT9基因改变最终导致细胞基因组不稳定，易向肿瘤转变。SEPT9基因通过选择性剪接可产生18种不同的转录本，共可编码15种不同的多肽段。mSEPT9在结直肠癌中高甲基化，在其他肿瘤及正常细胞中甲基化程度低［13］。在血浆中，mSEPT9被认为是结直肠癌特异性的肿瘤标志物，同时也是一种无创、简便、易行的筛查和早期诊断指标［2］。Warren 等［14］报道mSEPT9在结直肠癌中的阳性率达90%。Lee等［15］报道mSEPT9在结直肠癌中的阳性率为36.6%。研究报道，mSEPT9基因用于检测结直肠癌的阳性率分别为71.05%和80.0%［4，7］。本研究共纳入214例患者，利用Epipro Colon 2.0试剂盒检测mSEPT9，手术治疗前mSEPT9阳性率为70.1%，阳性率与TNM分期相关，与性别和年龄不相关。上述研究结果提示血浆mSEPT9是高效特异的非侵入性诊断结直肠癌的分子标志物。

血浆mSEPT9在结直肠癌根治术评价及复发监测中的价值尚缺乏报道。本研究发现术后血浆mSEPT9阳性率为8.4%，与术前（阳性率70.1%）相比差异具有统计学意义（P＜0.001），提示血浆mSEPT9可以用于结直肠癌手术疗效评价。在复发监测中，本研究结果显示术后随访监测复发转移血浆mSEPT9阳性率为78.1%，提示血浆mSEPT9可以作为结直肠癌患者术后监测预后的分子标志物。本研究还发现，术后血浆mSEPT9持续阳性的患者多数在1年内复发转移，虽然样本例数较少，但也进一步提示mSEPT9阳性可能与患者的不良预后相关，这与文献报道相一致［16］。

血清CEA是结直肠癌诊断中常用肿瘤学标志物，被广泛用于已行手术根治的结直肠癌患者的随访监测。本研究结果显示，手术后血清CEA浓度显著降低，与手术前CEA浓度相比差异具有统计学意义［（1.44±1.68）ng/mLvs.（5.34±10.19）ng/mL，P＜0.001）］，进一步证实血清CEA可用于结直肠癌手术疗效评价。另外，手术前后或化疗过程中血清CEA水平的变化常被用来判断治疗效果［17］。Tong等［18］研究认为术后血清CEA水平升高是结直肠癌患者复发转移的风险因素，在复发转移的结直肠癌患者中，血清CEA检测阳性率为40.6%，说明血清CEA可以用于结直肠癌复发监测。但血浆mSEPT9在结直肠癌复发转移患者中检测阳性率为78.1%，与血清CEA相比差异具有统计学意义（P＜0.001），提示血浆mSEPT9在结直肠癌复发监测中优于血清CEA检测。同时，本研究表明血浆mSEPT9联合血清CEA检测可以提高监测结直肠癌复发转移的检出率，提示联合检测可以作为结直肠癌术后复发转移更灵敏的监测方法。

综上所述，本研究发现血浆mSEPT9不仅适用于结直肠癌辅助诊断，而且在结直肠癌手术疗效评价及复发转移监测中均具有良好的灵敏度。但本研究中血浆mSEPT9所采用检测方法仅为定性的PCR技术，研发灵敏度高的定量检测方法可能更有利于结直肠癌患者术后复发监测。同时，多中心、大样本量的临床研究将对该技术的临床推广更有意义。