广东不同地区引种油棕叶片解剖结构对油棕抗寒力的影响

曾宪海，焦云飞，廖子荣，潘登浪，林位夫

（1.中国热带农业科学院橡胶研究所/农业农村部儋州油棕种质资源圃，海南 儋州 571737；2.华中农业大学园艺林学学院，湖北 武汉 430070；3.海南大学热带农林学院，海南 海口 570228）

油棕是典型的热带植物，适宜生长温度为22～33℃［1］，我国热区地处热带北缘，风、寒、旱等自然灾害时有发生，其中低温寒害往往给热作生产造成重大损失［2］。油棕的抗寒能力存在个体差异且因品种而异［3］，具有明显的生态型特点，是油棕遗传适应性对生态环境表现出的适应能力的差异所致，不但表现在生长上，也表现在其高产特性上。前期广东引种调查发现了一些油棕植株无明显寒害症状且能正常生长结果，这些优株在当地经过了长期的自然驯化，有可能存在重大的有益变异［4］。因此，评价、挖掘与利用这些优株对发展我国油棕产业具有重要意义。

目前，国内外油棕抗寒性研究主要集中在田间寒害调查、组织形态观察、生理生化和分子生物学评价等方面［3，5］，其中应用电导率及Logistic方程比较植物组织的低温半致死温度（LT50）能较为准确地鉴定植物抗寒性并取得比较一致的结果［6-8］。叶片是植物对低温胁迫最敏感的器官之一，叶片的解剖结构对不同环境条件具有响应和适应机制，是评价林木抗寒性的重要指标［9］。Luis等［10］比较了温室和试管培养条件下油棕实生幼苗的叶片解剖结构差异，发现两种生长环境条件下叶片组织结构的基本组成相同，但温室苗的表皮细胞和角质层比试管苗的厚且中脉较粗。曹红星等［11］研究了油棕实生幼苗的叶片在不同低温处理下解剖结构的差异，认为叶片总厚度和细胞组织疏松度在不同低温处理下变化明显，可作为油棕抗寒种质鉴定的结构指标。阮志平［12］研究认为，布迪椰子、沼地棕和油棕的抗寒性差异与叶片是否分化出栅栏组织和海绵组织有显著相关性，同时，具有薄的角质层和上栅栏组织，且栅栏组织细胞较长、细胞排列疏松与油棕的弱抗寒性有一定的关系。刘蕊等［13］通过对5个椰子品种植株一年生幼苗的叶片解剖结构进行观察，认为栅栏组织厚度、叶片总厚度、上（下）角质层厚度、上（下）表皮厚度和海绵组织厚度均可作为抗寒性鉴定的参考指标。本研究在前期调查基础上，对引种广东深圳、东莞、茂名、化州、湛江和雷州6个地区的油棕居群共38株油棕大树进行了叶片解剖结构和低温半致死温度的观测和比较分析，旨在为进一步筛选利用抗寒高产油棕种质提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以从海南引种广东深圳市区（114°01′E、22°32′N，以下简称深圳）、东莞植物园（113°44′E、22°58′N，以下简称东莞）、茂名市区（110°56′E、21°39′N，以下简称茂名）、化州广东农垦热作所（110°30′E、21°38′N，以下简称化州）、湛江市区（110°24′E、21°12′N，以下简称湛江）和雷州市区（110°05′E、20°54′N，以下简称雷州）6个地区（居群）中的38株油棕大树为研究对象，其中深圳12株（株号为SZ1～SZ12）、东 莞 2株（ 株 号 为 DG1～DG2）、 茂 名 8株（株号为MM1～MM2）、化州8株（株号为HZ1～HZ8）、湛江 5株（株号为 ZJ1～ZJ5）、雷州3株（株号为LZ1～LZ3）。油棕的具体地理分布信息可参考Zeng等［8］的报道。叶片解剖结构特征观察所需材料于2014年4月初采集油棕树冠向阳面中部健康叶片（约第17片叶）叶轴中间两边的小叶各3～4片，于每片小叶中间处剪取宽1～2 cm的叶片材料进行FAA液固定处理24 h以上。选取其中4个叶样做成石蜡，每个石蜡制片9～12个，选取4个较好的切片进行观察。LT50测定所需材料于2014年4月初晴天下午采集油棕叶片样品，按单株采集，每株3份叶样，叶样选取约第17片叶叶轴中部两边小叶，用长柄拉刀紧靠叶轴中部快速割断小叶，选取健康、完整小叶若干，将小叶叶柄切口处用湿润沙布包裹，然后放入塑料袋（平放20 cm×35 cm），封口并迅速带回实验室测定。

1.2 试验方法

1.2.1 叶片解剖结构观察 参照李正理的植物叶片石蜡切片法［14］并进行适当改良，具体步骤包括取材与固定、洗涤与脱水、透明、浸蜡、包埋和修蜡、切片、展片和粘片、脱蜡和染色、封片处理。采用Leica DMLB研究用生物显微镜对切片进行观察并用Leica DFC500数字图象照相机进行拍照，采用ImageJ软件测量叶片总厚度（LT）、叶肉细胞厚度（MCT）、栅栏组织（PT）和海绵组织厚度（ST）、上角质层（DCT）和下角质层厚度（BCT）、上表皮层（DET）和下表皮层（BET）厚度、上内皮层（DHT）和下内皮层（BHT）厚度以及中脉维管束长度（MVBL）和宽度（MVBW），以上指标单位均为微米（μm），并计算细胞结构紧密度（CTR，%）、细胞结构疏松度（CSR，%）和栅栏组织厚度与海绵组织厚度比（P/S，栅海比）。叶片中脉维管束的厚度选择中脉中较大的5个维管束进行测量并以中脉维管束的长度（与表皮垂直方向）和宽度（与表皮平行方向）来对其厚度进行描述。每份样品观测4个切片，每个切片每个指标取10个视野测量。

1.2.2 LT50测定 参照曾宪海等［7］的方法，油棕植株LT50（单位为℃）的测定数据均为3次重复平均值，油棕居群的数据均为所在居群全部植株测定数据的平均值。

1.2.3 方差分析、表型相关性分析和通径分析 6个居群共38株油棕植株的15个叶片解剖结构特征参数与油棕居群和植株的LT50观测数据进行方差分析、表型相关分析和通径分析，其中通径分析参照曾宪海等［7］的方法，以分析决定性状之间的内在关系。本研究为阐明油棕叶片解剖结构特征对油棕抗寒力的影响，以LT50为自变量、叶片解剖结构特征为因变量，考察因变量和自变量之间的因果关系。一个性状j对因变量（y）的直接影响（p）是通过一个单方向路径揭示的，对因变量的直接影响用pij表示；而其间接影响是通过交互路径揭示的，即一个性状i对因变量（y）的影响是经由另一个性状j来实现，性状ij的相关系数用rij表示，i≠j对因变量的间接影响用rijpjy表示。

利用Excel软件对原始数据进行统计分析，采用DPS 7.05数据处理系统进行方差分析、表型相关性分析和通径分析［15］。

2 结果与分析

2.1 油棕叶片解剖结构的基本特征

油棕叶片上、下表皮细胞层数均为1层，表面均覆盖着一层角质层，且上、下表皮细胞中均有气孔结构；上、下内皮层细胞分别位于上、下表皮细胞的下方，呈无色且比表皮细胞大，细胞层数绝大部分为2层；叶肉由栅栏组织和海绵组织组成，栅栏组织无分化，仅有下栅栏组织，栅栏组织细胞层数大部分为2～3层，而海绵组织为4～6层，均为等径形状的薄壁细胞组成，属同质绿色组织，细胞间隙小（图1，封二）。叶片中脉维管束数量4～12个，为外韧型维管束（木质部在叶背面、韧皮部在叶腹面），内含原生木质部、后生木质部、韧皮部和厚壁组织，并形成一个密集的厚壁组织鞘，其中较大的中脉维管束含多个独立韧皮部。中脉维管束排列形式多样，其中以卵形、菱形和五边形居多（图2，封二）。

2.2 油棕植株和居群的叶片解剖结构及其抗寒力的差异比较分析

油棕的15个叶片解剖结构特征参数以及LT50在38株植株个体之间均存在极显著差异（表1）。深圳居群中的SZ3植株叶片的上内皮层和下表皮层厚度最小，SZ5的上角质层厚度、栅栏组织厚度、下内皮层厚度、叶肉细胞厚度、细胞结构紧密度、栅海比和最大的细胞结构疏松度最小，SZ6的海绵组织厚度和细胞结构疏松度最小，SZ7的叶片总厚度最小，SZ8的中脉维管束长度最小。HZ5的下角质层厚度最小，HZ6的中脉维管束宽度最小，HZ2则以

上表皮层厚度最小、上皮内层厚度最大。MM2的海绵组织厚度和下角质层厚度最大，而细胞结构紧密度和栅海比则以MM3最大，此外，MM4、MM6和MM7以下表皮层厚度、上表皮层厚度和下内皮层厚度最大。ZJ4的栅栏组织厚度、叶肉细胞厚度和叶片总厚度最大，而ZJ5中脉维管束宽度最大，LZ3则以上角质层厚度和中脉维管束长度最大。植株LT50以SZ1为最大（-2.69℃）、SZ7最小（-6.19℃）。在6个油棕居群的15个叶片解剖结构特征参数中，仅叶片的中脉维管束长度（P= 0.0856）和细胞结构疏松度（P= 0.3718）在居群之间没有显著差异（表2）。而居群的LT50以雷州居群最大（-3.13℃）、东莞居群最小（-5.44℃）。

表1 油棕植株的叶片解剖结构指标测定结果

表2 油棕居群的叶片解剖结构指标测定

2.3 油棕植株和居群的叶片解剖结构与其抗寒力的相关性分析

相关系数越大表明关系强度越高。Cohen将相关系数（r）为 r ≥ 0.70、0.69 ＞r＞ 0.50、0.49 ＞r＞ 0.30和0.29 ＞r≥ 0.10分别评价为关系强度非常高、高、中等和低4个等级［16］。相关分析结果（表3～表4）表明，无论是油棕植株还是居群，其叶片的中脉维管束宽度与其他解剖结构特性之间均无显著相关性，居群叶片的上角质层厚度、下内皮层厚度、下表皮层厚度和中脉维管束长度与其他叶片解剖结构特性之间也没有显著相关性。油棕植株和居群的叶片上表皮层厚度与下角质层厚度（分别为r= 0.46**和r= 0.93**）和细胞结构紧密度（分别为r= 0.41**和r= 0.80*）均呈显著正相关关系，但居群的相关性较强；栅栏组织厚度与叶肉细胞厚度、叶片总厚度、细胞结构紧密度和栅海比均呈非常强的正相关关系；海绵组织厚度与叶肉细胞厚度、叶片总厚度和上内皮层厚度呈显著正相关关系；下角质层厚度与细胞结构紧密度、栅海比显著正相关，但居群的相关性较强；叶肉细胞厚度与叶片总厚度、细胞结构紧密度显著正相关；细胞结构紧密度与细胞结构疏松度成显著负相关（分别为r= - 0.45**和r= - 0.94**）、与栅海比呈显著正相关（分别为r= 0.88**和r= 0.99**）；细胞结构疏松度与栅海比呈显著负相关（分别为r= - 0.79**和r= - 0.97**）。而油棕植株和居群的叶片解剖结构特征与其所对应的植株和居群的林LT50之间均没有显著相关性。

2.4 影响油棕抗寒力的主要叶片解剖结构因子

以LT50作为抗寒力鉴定指标，LT50越小，抗寒力越强。由表5可知，在油棕植株叶片解剖结构特征中，海绵组织厚度对植株LT50的影响最大且有负向直接影响（p2y= - 4.0199），其次为栅/海比（p11y= - 2.341），且叶肉细胞厚度经由海绵组织厚度也具有最大的负向间接影响（r72p2y= - 3.506）；而叶片总厚度有最大的正向直接影响（p8y= 2.6694），其次为细胞结构紧密度（p9y=1.369），且叶肉细胞厚度经由叶片总厚度也具有最大的正向间接影响（r78p8y= 2.572）。表明植株叶片的海绵组织厚度和栅/海比越大，植株的LT50越小、抗寒力越强，而叶片总厚度和细胞结构紧密度的影响作用则相反。此外，由于决定系数（0.27839）偏小、剩余通径系数（0.84948）较大，说明27.8%的LT50表型变异是由表5中所列的结构因子决定的，但未知因素可能占LT50表型变异的72.2%，表明影响LT50的更重要因素尚未考虑在内［17］，因此本研究中的叶片解剖结构特征应是油棕植株抗寒力形成的次要因素。

表3 油棕植株抗寒力与叶片解剖结构特征的相关性分析

表4 油棕居群抗寒力与叶片解剖结构特征的相关性分析

从表6可以看出，上角质层厚度是影响油棕居群LT50的主要决定因子且具有最大的正向直接作用（p1y=1.0149），其次为细胞结构疏松度（p4y=0.648），影响强度最低的为上内皮层厚度（p2y=0.230），而细胞结构疏松度经由上角质层厚度则具有最大的负向间接影响（r11p1y=-0.463）。维管束长度具有最大的负向直接作用，但影响强度低（p3y=-0.149），而维管束长度经由上角质层厚度则具有最大的正向间接影响（r31p1y=0.178）。表明较低的上角质层厚度和细胞结构疏松度有利于提高油棕居群的抗寒力。

表5 油棕叶片解剖结构特征对植株抗寒力的直接（对角线）和间接（非对角线）影响

表6 油棕叶片解剖结构特征对居群抗寒力的直接（对角线）和间接（非对角线）的影响

3 结论与讨论

低温影响油棕的生长和产量［3］。低温胁迫时，植物细胞膜透性增大，细胞内电解质外渗，因此，可通过测定相对电导率的大小来反映植物的抗寒性［6］，这在许多植物上得到了应用［18-19］。而叶片是植物进化过程中对环境变化较敏感且可塑性较大的器官，其结构特征最能体现环境因子对植物生长的影响或植物对环境的适应，常被用作植物抗寒性鉴定依据之一，但因不同植物在解剖结构上的抗寒机制不同，因此影响植物抗寒力的主要结构因子也不尽一致［20］。Luis等［10］研究发现温室和试管生长条件下的油棕实生幼苗的叶片解剖结构发育存在差异，且较大的叶片角质层厚度有利于提高植物的环境适应性。曹红星等［11］认为叶片总厚度和细胞结构疏松度因低温胁迫时变化明显，可作为油棕抗寒种质鉴定的结构指标。马婷等［18］在比较不同核桃品种的抗寒性时发现，叶片细胞结构疏松度、海绵组织厚度和叶片总厚度越大，核桃抗寒力越强，认为是这评价核桃抗寒性的重要指标。

本研究发现油棕植株之间的叶片解剖结构和LT50均存在显著差异，但叶片中脉维管束长度和细胞结构疏松度在居群之间则没有显著差异。此外，油棕植株叶片中脉维管束宽度以及居群叶片的上角质层厚度、下内皮层厚度、下表皮层厚度、中脉维管束长度和宽度与其他解剖结构没有显著相关性，且油棕植株和居群的叶片解剖结构与其所对应的LT50均无显著相关性。以LT50为抗寒力鉴定指标，LT50越小，抗寒力越强。通径分析表明，叶片海绵组织厚度是是决定油棕植株抗寒力的主要结构因子（p2y= - 4.0199），海绵组织厚度越大，植株抗寒力越强，但上角质层厚度则是对油棕居群抗寒力起重要决定作用的结构因子（p1y= 1.0149），即较薄的上角质层厚度有利于诱导油棕居群抗寒力的增强，依此可分别筛选出MM2（109.99 μm）和SZ6（51.46 μm）为抗寒性最强（-4.62℃）和抗寒性最弱（-5.00℃）植株，深圳（1.79 μm）和湛江（2.46 μm）为抗寒性最强（-4.68℃）和抗旱性最弱（-3.62℃）居群。而筛选的结果与LT50的实际测定结果不一致，且与其他学者的研究结果不尽相同。Luis等［10］认为，叶片角质层厚度的增加，在植物自身防御与抗逆等方面扮演重要角色，如较厚的角质层限制了病原体的侵染，减少了营养元素以及其他物质的渗出，提高了植物环境适应性。阮志平［12］研究认为，油棕叶片的海绵组织厚度、栅栏组织的层数和厚度、细胞组织紧密度和疏松度以及栅海比等指标都不宜用于鉴定植株抗寒能力，而与栅栏组织分化显著相关。蔡永立等［21］研究认为，植物叶片的上、下表皮层细胞厚度、栅栏组织和海绵组织厚度以及叶片总厚度的增加是植物对低温环境的反应。王明启等［22］通过蔷薇属切片发现，耐寒品种的栅栏组织厚度较大，而不耐寒品种的海绵组织厚度较大。李剑等［23］认为植物叶片解剖结构的细胞组织紧密度越大、细胞组织疏松度越小，其抗寒性越强。鉴于植物的抗寒性是一个复合性状，不但存在遗传差异，也易受到环境和栽培条件等影响，因此利用单一指标很难反映植物抗寒性实质，应同时采用多种方法进行相互验证才能得到比较准确的结论［6］。

图1 油棕叶片横切面（100×）

图2 油棕叶片中脉横切面（100×）