降解黄曲霉毒素B1菌株的筛选及毒素降解酶的分离

左瑞雨，尹清强，常 娟，刘洪兵，王二柱，朱 群

(1.河南省畜牧总站，河南 郑州 450008; 2.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002;3.泌阳县畜牧局，河南 泌阳 463700; 4.河南德邻生物制品有限公司，河南 新乡 453000)

黄曲霉毒素是由黄曲霉(Aspergillusflavus)、模式曲霉(Aspergillusnomius)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等产生的一类次级代谢产物，包括黄曲霉毒素B1(AFB1)、B2、G1、G2等共计20余种，其中以AFB1的毒性最强，具有极强的致畸、致癌和致突变作用，被世界卫生组织列为一类致癌物[1-2]。全球每年约有四分之一的谷物因污染霉菌毒素而无法直接饲用或食用，每年由各种霉菌毒素导致的经济损失高达数千亿美元[3]。目前的预防和监测技术很难预测或者防止霉菌毒素在饲料原料收获、贮藏和加工过程中的污染，因此，抑制霉菌毒素产生并对被霉菌毒素污染的粮食作物进行有效的脱毒处理，是降低损失、保障人类健康行之有效的方法[4]。从目前市场上销售的去除霉菌毒素的产品来看，大多采用在饲料中添加蒙脱石、硅铝酸盐和活性炭等物理吸附剂来进行脱毒处理，其脱毒原理均为霉菌毒素与吸附剂的物理吸附。此类吸附剂在稳定的体系中具有一定的去除霉菌毒素的能力，但当所在体系的温度、pH值和离子浓度改变时，复合体上吸附的霉菌毒素极易从吸附剂上解离，解离后其毒性依然存在。除此之外，吸附类的脱毒剂对饲料中的维生素、微量元素等成分也具有一定的吸附作用，降低这些营养元素的利用率，严重情况下还会导致采食此类饲料的畜禽出现各种营养缺乏症[5]。因此，研究效率高、成本低廉的脱毒方法对发霉粮食和饲料原料进行脱毒成为降低霉菌毒素危害的关键。目前，通过微生物或者微生物发酵产生的毒素降解酶来处理被霉菌毒素污染的粮食和饲料原料已成为研究的热点，主要由于其具有脱毒效率高、处理成本低和无有毒有害残留等优点[6-7]。本研究通过筛选得到具有降解AFB1能力的微生物，并分离纯化AFB1降解酶，以期为下一步研发应用于畜禽养殖缓解霉菌毒素对动物的危害的产品提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 电子天平、超净工作台、高压灭菌器、恒温培养箱、气浴振荡器、涡旋混合仪、酶标仪、离心机、酸度计、磁力搅拌器、电热鼓风干燥箱、水平电泳装置、凝胶层析装置、凝胶成像分析系统、垂直电泳装置等。

1.1.2 菌种 菌株来源于森林中的腐叶、土壤、灵长类动物粪便，以及河南农业大学动物营养与生物技术实验室保存的微生物。

1.1.3 主要试剂 大豆蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、可溶性淀粉、氯化钾、氯化钡、硫酸亚铁、磷酸二氢钾、三氯乙酸、硫酸铵、硝酸铵、硫酸镁、琼脂粉、考马斯亮蓝R-250、HCl、Tris等，葡聚糖凝胶Sephadex G-100，透析袋。AFB1由黄曲霉菌(CGMCC 3.4408)固体发酵后抽提获得，毒素含量约100 mg/kg。

1.1.4 培养基

1.1.4.1 初筛培养基 硫酸镁0.25 g，磷酸二氢钾0.25 g，硝酸铵1 g，硫酸亚铁0.001 g，琼脂17 g，先用蒸馏水溶解，之后调整pH值至7.0，然后定容至1 L，高压蒸汽灭菌25 min，取出后置于超净工作台中冷却至50 ℃左右时制作固体平板。

1.1.4.2 PDA培养基 酵母2 g，可溶性淀粉6 g，大豆蛋白胨5 g，葡萄糖20 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，KH2PO41 g，琼脂粉15 g，先用蒸馏水溶解，然后再定容至1 L，高压蒸汽灭菌25 min，取出后置于超净工作台中，冷却至50 ℃左右时制作固体平板。

1.1.4.3 固体发酵培养基 麸皮∶豆粕∶玉米(质量比)=6∶2∶3，按照固体物料∶蒸馏水=1∶1(质量比)的比例加水，混合均匀后按30 g/瓶分装于250 mL三角瓶中，高压蒸汽灭菌30 min，取出后置于超净工作台中冷却后备用。

1.2 试验方法

1.2.1 降解AFB1菌株的初筛 将收集的腐叶、土壤、灵长类动物粪便以及实验室保存的微生物等用生理盐水稀释10～100倍后，取稀释液100 μL接种于涂布有AFB1的初筛培养基中(AFB1质量浓度100 μg/mL)，然后将平板放置于30 ℃恒温培养箱中，以未涂布AFB1的平板作对照。培养4 d后用灭菌后的接种环挑取平板中较大的菌落再次接种于涂布AFB1的固体平板中，以菌落的大小和生长速度作为初筛的依据。挑取生长良好的菌株，接种于PDA固体平板，30 ℃培养3 d后保存菌种。

1.2.2 降解AFB1菌株的复筛

1.2.2.1 降解AFB1真菌降解酶粗酶液的提取 用灭菌后的接种环挑取2次筛选后生长良好的真菌孢子以划线方式接种于PDA平板，置于30 ℃恒温培养箱中培养4 d。向平板中加入含有0.05%的Tween 80(体积分数)的灭菌生理盐水8 mL，用涂布棒小心将孢子刮下，用灭菌过的8层纱布过滤以除去菌丝残体，然后将孢子调整为约1×108cfu/mL，按5 mL/瓶接种于灭菌后的固体发酵培养基，用灭菌玻璃棒搅拌均匀后置于30 ℃恒温培养箱，7 d后收获。按照固体发酵物∶生理盐水=1∶2的比例(质量比)加入生理盐水，搅拌均匀后室温条件下浸泡1 h。将浸泡后的发酵物用多层纱布过滤，之后10 000 r/min离心5 min，然后分离上清液置于4 ℃冰箱保存备用(此液体即为粗酶液)。

1.2.2.2 降解AFB1菌株对AFB1的降解 将粗酶液先用0.20 μm的滤膜过滤除菌，然后取15 mL向其中加入AFB1，使反应体系中AFB1的质量浓度约为35 μg/L，置于30 ℃气浴振荡器恒温振荡培养，48 h后取样测定AFB1的含量，以甲醇-PBS缓冲液加入同等质量浓度的AFB1作为对照。

1.2.3 AFB1降解酶的分离纯化与检测

1.2.3.1 AFB1降解酶的盐析及透析 取含有AFB1降解酶的粗酶液，按517 g/L的量加入硫酸铵，搅拌使其完全溶解后置于4 ℃冰箱8 h，之后3 000 r/min离心10 min，收集离心后的沉淀小心转移至透析袋中，将其悬浮于10 mmol/L Tris-HCl (pH值7.4)的烧杯中进行透析，按照30 min/次的频率更换其中的Tris-HCl溶液，用10%氯化钡溶液检查烧杯中硫酸根离子的浓度(用蒸馏水作空白对照)，待透析后烧杯内无沉淀生成时停止透析，留透析袋内液体供下步凝胶层析使用。

1.2.3.2 凝胶层析分离AFB1降解酶 用电子天平称量10 g Sephadex G-100，小心转移至容量500 mL的烧杯中，加入洗脱液150 mL，室温条件下溶胀2～3 d，倾泻多次以去除极细微粒，然后将溶胀后的凝胶100 ℃水浴处理2 h。将2.5×20 cm的层析柱固定于铁架台上，先注入约8 cm高度的洗脱液，之后将处理好的凝胶贴壁倒入层析柱中，待凝胶沉积2 cm后打开下部阀门，控制流速约为5 mL/10 min。待凝胶沉积高度达15 cm后停止装柱，最后用2倍柱床体积的洗脱液平衡凝胶柱，使凝胶层析柱稳定。用胶头滴管将经过盐析和透析处理后的粗酶液缓慢加入凝胶柱顶部，按照3 mL/5 min速度加样(加样的同时即开始收集洗脱液)，保持3 mL/10 min的洗脱速度进行洗脱，按照5 min/管的时间间隔更换收集管收集洗脱液，按顺序用阿拉伯数字编号。洗脱过程中所用洗脱液体积一般约为凝胶柱体积的6倍以上。

1.2.3.3 AFB1降解酶的SDS-PAGE检测 取凝胶层析后不同收集管内的AFB1降解酶20 μL与样品缓冲液按1∶1(体积比)混合，100 ℃水浴处理3 min后立即置于冰浴快速降温。将处理后的样品用移液器小心滴入浓缩胶的点样孔。样品在浓缩胶时维持80 V电压，样品通过浓缩胶后调至120 V直至电泳结束。将凝胶置于5倍体积的考马斯亮蓝R-250染色液中室温条件下振荡染色过夜，之后取出凝胶将其浸泡于考马斯亮蓝脱色液中进行脱色处理，待凝胶空白区域洗脱至无色时拍照保存。

1.2.4 凝胶层析分离AFB1降解酶对AFB1的降解

选择SDS-PSGE检测后有条带的收集管内的AFB1降解酶各6 mL，加入由黄曲霉菌(CGMCC 3.4408)固体发酵后抽提获得的AFB1，使其在体系中的质量浓度约为120 μg/L，混匀后置于30 ℃条件下恒温培养48 h后选用德国RIDASCREEN公司AFB130/15的96孔酶联免疫试剂盒测定剩余的AFB1含量。

1.2.5 AFB1降解菌株的菌种鉴定 首先挑取降解AFB1最高的真菌Y8涂布PDA固体平板，30 ℃培养至有单菌落生长即停止培养，挑取带有孢子的菌丝体置于显微镜下观察。将真菌Y8的孢子接种于PDA液体培养基，培养48 h后经多层纱布过滤，取菌丝体，液氮研磨后采用真菌基因组提取法提取Y8的基因组DNA，采用TakaRa Fungi Identification PCR Kit扩增目的片段，切胶回收后用Seq Forward作为引物采用26S rDNA ITS(Internal transcribed space)区序列解析进行测序，测序结果在NCBI中进行同源序列分析，筛选同源性较高的序列构建系统发育树。

1.3 数据处理

采用SAS 6.12软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 降解AFB1菌株的筛选

以AFB1为唯一碳源和能源经过2次重复筛选，共筛选出9株真菌(图1)，分别编号为Z4、Y3、Y6、Z8、Z9、Y8、Z5、Y10、Z3。与空白对照组相比较，9株真菌直接降解AFB1的结果分别为14.65%、50.01%、36.96%、57.38%、71.75%、77.05%、25.35%、52.48%和43.81%，真菌Y8对AFB1降解率最高，高达77.05%。

2.2 AFB1降解酶SDS-PAGE检测结果

由图2可知， 真菌Y8发酵液凝胶层析过程中从第5管开始有明显蛋白质条带。经测量并与蛋白质Marker进行比对，第2泳道较明显的条带(第6收集管)蛋白质分子质量为109.4 ku；第3泳道较明显的条带(第7收集管)蛋白质分子质量为80.4 ku；第4、5泳道较明显的条带(第8、9收集管)蛋白质分子质量约为31.7 ku，第6、7、8和9泳道较明显的条带(第10—13收集管)蛋白质分子质量约为 29.6 ku。

1：蛋白质Marker；2—11：凝胶层析过程中第6—15收集管中的洗脱液

2.3 真菌Y8发酵液凝胶层析后AFB1降解酶对AFB1的降解结果

将凝胶层析后将检测蛋白质分子量相同的收集管合并为处理组，进行AFB1毒素降解试验。由图3可知，凝胶层析后第8、9收集管蛋白质分子量约为31.7 ku，与空白对照组比较，AFB1降解酶对AFB1降解率为54.33%。

1：凝胶层析过程中第5—6收集管；2：凝胶层析过程中第7收集管；

2.4 真菌Y8的菌种鉴定结果

2.4.1 真菌Y8的表型观察 Y8在PDA平板上生长迅速， 12 h后即有白色菌丝密布平板，之后黄色孢子快速产生，72 h后孢子颜色逐渐变为褐色(图4)。显微镜下观察带有孢子的菌丝体，可见真菌Y8的菌丝有隔膜，孢子呈串生，对照《真菌鉴定手册》[8]相关图片，初步判断真菌Y8为曲霉菌属。

图4 真菌Y8表型观察(5 d)

2.4.2 真菌Y8的ITS区基因扩增及测序 以真菌Y8的基因组为模板，采用TakaRa Fungi Identification PCR Kit扩增真菌Y8的ITS区，扩增出大小约650 bp的条带(图5)。

1：DL2000 DNA Marker；2：真菌Y8；

2.4.3 真菌Y8系统发育鉴定结果 以Seq Forward为引物采用26S rDNA ITS区序列解析进行DNA测序，将测序结果在NCBI中进行Blast比对，从GenBank数据库中筛选与真菌Y8同源性较高的26S rDNA序列，运用MEGA4软件计算序列相似性并进行系统发育分析(图6)。结果显示，真菌Y8在与同源性较高的序列所构建的系统发育树中，与米曲霉(Aspergillusoryzae)属于同一分支，其同源性达99%，因此，确定筛选得到的具有降解AFB1作用的真菌Y8为米曲霉。

图6 基于26S rRNA ITS序列的真菌Y8系统发育树

3 结论与讨论

3.1 降解AFB1微生物的筛选

目标微生物的筛选是根据筛选目的综合运用多种筛选方法，从含有目标微生物的样品中准确、有效的将目标微生物分离的过程。微生物的筛选一般包括样品的采集、微生物富集培养和菌株分离纯化等环节。李俊霞等[9]在筛选具有降解AFB1作用的微生物时，把香豆素作为能源和碳源，分离得到1株具有降解AFB1作用的嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，对AFB1的降解率达85.7%。李冰等[10]用实验室保存的黑曲霉直接进行AFB1降解试验，结果显示，黑曲霉对AFB1降解率高达93.28%，对黑曲霉降解AFB1的活性成分进行分离，测定结果显示，其胞外酶对AFB1的降解能力(84.20%)显著高于菌体细胞和胞内物质。孙丰芹等[11]采用在无碳培养基中添加香豆素的方法,从花生饼和土壤中筛选具有降解AFB1作用的菌株，最终从初筛得到的7株菌中筛选得到的TRS-3菌株，其液体发酵培养液上清液对AFB1的降解率达到78.55%，16S rDNA菌种鉴定结果显示，TRS-3菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)。关心[12]用香豆素作为AFB1的替代物筛选出对AFB1降解作用显著的菌株F6，降解率高达83.2%，通过生理生化鉴定初步判定其为芽孢杆菌属，之后通过16S rRNA菌种鉴定，结果显示，其核苷酸序列与蔬菜芽孢杆菌(Bacillusoleronius)的同源性达99.7%。王燕等[13]用香豆素为唯一碳源和能源筛选得到菌株WZ-4，降解率为75.25%，16S rDNA序列同源性分析显示其为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophilus)。在参照现有研究成果的基础上,本试验筛选能够降解AFB1的菌株，采用AFB1作为唯一能源和碳源的方法进行初筛，这样能够利用AFB1作为能源和碳源的菌株可正常生长，而不能利用的菌株生长则受到抑制，然后通过分离、富集培养，筛选得到对AFB1降解率高达77.05%的真菌Y8，真菌26S rDNA菌种鉴定和同源序列分析结果显示，具有降解AFB1作用的真菌Y8为米曲霉。与其他报道中筛选出的降解黄曲霉毒素的菌株相比，本研究筛选的米曲霉可采用固体发酵的方法生产AFB1降解酶，其产物无需采用载体吸附保护酶活性，可直接进行干燥处理，为下步毒素降解酶的规模化生产及其在动物养殖中的应用提供了便利。

3.2 降解AFB1活性物质的分离

酶的分离包括酶蛋白的发酵、提取、纯化、干燥及精制等步骤。酶的抽提常采用离心、盐析、过滤和萃取等方法，纯化过程主要采取层析、过滤和反渗透等措施。凝胶层析是目前应用较为广泛的蛋白质分离纯化技术，又称为分子筛、凝胶排阻和凝胶过滤层析等。凝胶层析是以多孔性凝胶为固定相，之后通过洗脱液按照被分离物质分子量大小顺序使其从混合体系中先后洗脱出来的液相色谱方法，因其处理过程温和、不改变被分离物质的活性，所以被广泛应用于蛋白质的分离及浓缩、蛋白质分子质量的测定以及核酸、多糖等生物大分子的分离纯化。有研究者从假蜜环菌(Armillariellatabescens)的菌丝体中分离出具有降解AFB1作用的复合多酶体系，采用硫酸铵分级沉淀、凝胶层析和离子交换层析从中分离得到对AFB1具有显著降解作用的黄曲霉毒素降解酶(Aflatoxin detoxifizyme)，其分子质量大小约为51.8 ku，降解AFB1试验结果显示，酶的回收率约10%[14-15]。Cao 等[16]对假蜜环菌降解AFB1的机制进行了研究，结果表明，AFB1毒性的消失是因为假蜜环菌产生的蛋白酶AFO作用于AFB1的呋喃环，从而达到降解AFB1的目的。Teniola等[17]的研究表明，分支杆菌(Mycobacteriumfluoranthenivorans)和红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)的液体培养液和菌体胞内酶，在30 ℃条件下培养4 h，对黄曲霉毒素B1的降解率均在90%以上，8 h后则可完全降解。Motomura等[6]采用色谱柱层析和疏水亲和层析相结合的方法从糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)中分离得到对AFB1具有显著降解作用的胞外酶，其分子质量为90 ku，对该酶脱毒条件进行优化后发现其在温度25 ℃、pH 值4～5时对AFB1降解率最高。杨文华等[18]对筛选得到的具有降解AFB1作用的施氏假单胞菌F4(PseudomonasStutzeri)进行发酵，采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose交换柱层析和葡聚糖凝胶Sephadex G-100等方法，分离纯化得到24 ku的AFB1降解酶，其回收率约56%。本试验采用硫酸铵分级沉淀和葡聚糖凝胶Sephadex G-100对含有AFB1降解酶的粗酶液进行分离纯化，得到31.7 ku的AFB1降解酶，但经硫酸铵沉淀和凝胶层析分离的AFB1降解酶对AFB1的降解率较粗酶液下降，这可能与粗酶液在盐析、层析过程中酶活性降低有关，亦有可能是层析过程中因大量洗脱液的加入导致AFB1降解酶的质量浓度降低，同时未对凝胶层析后的酶蛋白进行浓缩有关。