姜黄素对于老年痴呆症模型大鼠外周血单个核细胞中组织蛋白酶B表达的影响

陈汉泽， 李进伟， 师 含， 滕伟禹， 田 力

溶酶体组织蛋白酶通过影响β淀粉样蛋白(Amyloid-β,Aβ)的代谢从而参与了老年痴呆症(Alzheimer’s disease,AD)的发展进程[1]，但姜黄素(curcumin)对于其中组织蛋白酶B (Cathepsin B,Cat B)在外周血单个核细胞中的表达与AD进展的关系之前未有文献报道，本研究将Aβ1-42微量注射至大鼠右侧海马制作AD动物模型，经姜黄素处理后检测模型大鼠外周血单个核细胞中Cat B表达及活性变化，同时监测其行为学改变；探讨姜黄素对外周血免疫细胞中Cat B的作用，试图寻找姜黄素对于AD治疗作用的机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 Aβ1-42(Sigma)、姜黄素(Sigma，纯度>96%)。Morris水迷宫、脑立体定位仪(日本成茂公司)。DEPC、Trizol(Invitrogen)，Taq酶、dNTP、随机引物(TaKaRa)，引物DH5α感受态菌、琼脂糖、大鼠CathpesinB、GAPDH测序引物及Taqman探针(上海生工)，Aβ1-42、兔抗Aβ1-42多克隆抗体(Anaspec)，兔抗Cathpesin B多克隆抗体(Santa)，l640细胞培养基(invitrogen)，Cathepsin B Activity Assay Kit (BioVision)。其它常规试剂购自沈阳化学试剂采购供应站。定量PCR所用引物及探针序列(见表1)。

1.2 动物分组 健康雄性Wistar大鼠，体质量250～280 g，由中国医科大学实验动物中心提供。大鼠适应性喂养1 w后，经Morris水迷宫测试，4个象限测试中有2个象限超过2 min未找到安全平台者视为记忆障碍被淘汰。剩余30只大鼠被随机分为3组，每组10只，即假手术组、AD模型组和姜黄素干预组，其中5只用于外周血检测，另外5只用于行为学检测。

1.3 Aβ1-42致大鼠认知障碍模型的制备及给药 用无菌生理盐水将Aβ1-42稀释成10 μg/μl，37 ℃下孵育1 w，使其变为聚集态Aβ。大鼠常规吸入麻醉后固定于立体定位仪上，颅顶部正中切开皮肤，根据George Paxinos等1998年版《大鼠脑立体定位图谱》选择右侧海马CA1区为注射靶区，于前囟向后3.0 mm，中线旁开2.2 mm处，钻开颅骨，微量进样器自脑表面垂直进针2.8 mm，将Aβ1-42缓慢注入(10 μl)，留针10 min以保证溶液充分弥散，然后缓慢撤针，假手术组注入等体积PBS。干预组于建模后给予300 mg/(kg·d)二甲基亚砜溶解的姜黄素，连续腹腔注射7 d，假手术组、AD模型组大鼠分别腹腔注射等量二甲基亚砜。各组术后均单笼饲养至大鼠完全清醒。术后第9天腹腔麻醉心脏采血5 ml并分离单个核细胞；另一半动物同时进行行为学测试。

1.4 实时定量PCR方法各组外周血单个核细胞中Cat B基因表 采用Taqman探针相对定量法，以GAPDH作为归一化Cat B的持家基因。以构建的重组质粒DNA为标准品，以质粒初始模板绝对量的对数作横坐标、Ct值作纵坐标制作标准曲线。以“目的基因初始模板量/GAPDH初始模板量”比值代表每个标本目的基因的mRNA表达水平的相对量。每个标本重复检测两次，结果取均值。抽提对照组、AD模型组及姜黄素干预组(n=5)外周血单个核细胞的cDNA与质粒标准品同时进行RT-qPCR，扩增Cat B和GAPDH，根据标准曲线计算各标本Cat B初始模板量与GAPDH初始模板量比值。

1.5 Morris水迷宫行为学测试 对照文献方法[2]，于术后第9天，各组大鼠进行Morris水迷宫实验测定学习记忆能力。

1.5.1 定位航行试验 通过对训练大鼠游泳寻找平台，观测其逃避潜伏期长短可检测动物的学习能力。历时5 d，2次/d，将大鼠面向池壁分别从2个入水点放入水中，记录其在2 min内寻找到平台的时间(逃避潜伏期，escape latency)和游泳路径。如果大鼠在2 min未找到平台，潜伏期记为120 s，并由实验者用木棒牵引其至平台上，让大鼠停留10 s，再放回笼中。

1.5.2 空间探索试验 第6天撤除平台，任选一个入水点放入水中，记录2 min内大鼠在池中的游泳轨迹和时间，分别计算在各象限所停留时间的百分比。

1.6 单个核细胞中Cat B活性测定 如前分别于术后第9天采集外周血并分离单个核细胞，采用活性试剂盒检测其活性。操作过程按说明书，以相对荧光单位(RFU)表示蛋白酶活性。

2 结 果

2.1 姜黄素对于大鼠外周血单个核细胞中Cat B表达的影响 定量PCR结果显示，与假手术组及AD模型组相比，姜黄素干预组外周血单个核细胞中Cat B mRNA表达水平均上调(P<0.05，见图1)。

2.2 姜黄素对于大鼠外周血单个核细胞中Cat B活性的影响 蛋白活性分析结果显示，与对照组及AD模型组相比，姜黄素干预组外周血单个核细胞的Cat B活性提高(P<0.01，见图2)。

2.3 AD模型大鼠在Morris水迷宫中定向航行和空间探索试验的表现 各组大鼠平均逃避潜伏期随着游泳时间的延长而缩短，说明各组大鼠在5 d的游泳训练期间学习寻找平台的能力逐次提高。组间两两比较显示:从第2天开始，AD模型组平均逃避潜伏期较假手术组明显延长(P=0.014)；姜黄素干预组与AD模型组相比，平均逃避潜伏期明显缩短(P=0.026，见表2)。

表1 定量PCR所用引物及探针序列

注：Taqman 探针5’端标记荧光报告基团FAM;3’端标记荧光淬灭基团TAMRA

表2 各组大鼠定向航行试验平均逃避潜伏期

与对照组比较*P>0.05；与AD组比较#P<0.05

图1 姜黄素对大鼠外周血单个核细胞中Cat B mRNA表达的影响

图2 姜黄素对大鼠外周血单个核细胞Cat B 活性的影响

3 讨 论

AD是引起老年人群痴呆的最主要原因,其病因、发病机制不清，尚无确切治疗方法[3]。近年来研究结果显示外周获得性免疫反应与AD的发病及进展相关，Aβ1-42在脑内沉积、引发神经元凋亡是AD发病的中心环节，对于Aβ清除能力的下降是疾病发生发展的主要原因[4～6]。

Cat B是蛋白酶家族成员，在哺乳动物细胞溶酶体内主要体现蛋白水解活性，能够降解以内吞或吞噬的方式进入到内体/溶酶体的蛋白及多肽。研究显示[7,8]：Cat B及Cat D活性失调可能导致年龄相关的病理变化，包括自噬体的聚集以及脂褐质的形成均导致神经功能失调等损伤。同时细胞内未水解产物的不断聚集也增加了细胞的抗氧化压力。动物体内研究发现[7]：Cat B有助于APP小鼠脑内斑块的清除；同时有研究证实Cat D在AD患者外周血单核细胞、淋巴细胞及皮肤成纤维瘤细胞中表达均下调[9～11]。但Cat B在大鼠脑内注Aβ1-42后外周血单个核细胞中的表达情况及姜黄素对其表达的影响尚未见文献报道。

姜黄素具有抗肿瘤、抗炎、抗HIV、抗菌、抗氧化等多种药理作用，是从植物姜黄根茎中提取的一种酚类化合物，它可以通过抗氧化和抗炎等作用改善糖尿病等代谢性疾病、自身免疫疾病、动脉粥样硬化等多种疾症[12]。本实验以脑内注入Aβ1-42诱导制作的AD模型大鼠为研究对象，检测姜黄素对大鼠外周血单个核细胞中Cat B表达的作用及对于认知功能的影响，探讨姜黄素对AD的防治作用。

通过定量PCR方法显示：大鼠脑内注入Aβ1-42后外周血中Cat B表达无明显变化，但姜黄素干预后AD模型组外周血单个核细胞中Cat B mRNA表达水平均明显上调。为进一步探讨Cat B表达上调的同时是否伴有酶活性的改变，我们如前分别采集对照组、AD模型组及姜黄素干预组外周血并分离单个核细胞，采用活性试剂盒检测其活性，结果显示：姜黄素干预后AD模型组单个核细胞中Cat B活性明显提高。行为学分析结果也说明：和假手术组相比，Aβ1-42诱导的AD模型组大鼠学习记忆能力明显减退，也说明AD动物模型造模成功。而姜黄素干预处理后，平均逃避潜伏期较AD模型组明显缩短(P=0.026)。即姜黄素对改善认知功能障碍大鼠的学习及记忆能力的改善有一定促进作用。

动物体内实验表明[13,14]：姜黄素可以抑制AD小鼠脑内Aβ的沉积，甚至使已经沉积的神经纤维斑块体积变小；APP/PS1大鼠脑组织、血清中TNF-α和IL-6水平升高，姜黄素处理后血清TNF-α和IL-6等炎性细胞因子水平降低。这些研究结果均说明姜黄素具有抗炎及神经保护作用。

目前AD的治疗仅限于药物对症疗法，未能有效延缓病程进展，同时因价格昂贵及副作用明显等原因应用范围有限。中药以其多靶位、低毒性的特点在改善和延缓早期轻度认知损害等方面显示出较好的疗效。本实验研究表明姜黄素在改善AD认知功能方面具有良好效果，为AD治疗提供新思路。接下来将进一步深入研究姜黄素通过影响Cat B表达在改善AD大鼠行为学表现的作用机制。