AEG-1和CHD5在胃癌中的表达及其临床意义

徐国帅，蔡相军，陈江波，吕庆，刘洪涛

（1. 中国人民解放军第202医院普通外科，沈阳 110812； 2. 中国医科大学研究生院，沈阳 110122）

胃癌在恶性肿瘤中的发病率位于第5位，并且是全球癌症相关性死亡的第三大原因［1］。大多数患者诊断出胃癌时已经发生淋巴结转移或者远处转移，还有部分患者经手术治疗后复发，胃癌术后的5年生存率只有30%左右［2］。因此，研究胃癌相关基因，有助于了解胃癌侵袭和转移的机制，可以对胃癌患者进行有效的靶向治疗并延长患者的生存时间。AEG-1首次在感染HIV-1的人胚胎星形胶质细胞中发现［3］。AEG-1能够促进细胞增殖、代谢、迁移、侵袭以及血管生成等，因此AEG-1的表达升高与多种肿瘤的临床分型、分期、转移和复发有关［4-5］。CHD5是定位于人染色体lp36的抑癌基因，它能够调节染色质重塑，达到抑制肿瘤发生发展的作用［6］。本研究探讨AEG-1与CHD5在胃癌中的联系，并且研究其表达情况与胃癌患者临床病理特征和术后生存率的关系，为胃癌患者提供新的预测生存率的指标和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取中国人民解放军第202医院普外科胃肠病区2012年1月至2013年1月收治的病历资料完整详细且病理确定为胃癌的患者58例。根据病历号，分别获取同一病例癌组织蜡块和癌旁组织蜡块 （距离肿瘤边缘＞5 cm） 。全部病例均实施开腹胃癌根治术，术前均未进行放化疗治疗，且征求患者及其家属意见，自愿参与本研究，征得随访同意。其中，男性患者44例，女性患者14例。年龄32～82岁，平均年龄63.05岁，中位年龄63岁。淋巴结转移40例，未转移18例。根据2009年第7版国际抗癌联盟胃癌TNM分期［7］：Ⅰ期15例，Ⅱ期15例，Ⅲ期24例，Ⅳ期4例。分化程度：低分化26例，中分化及高分化32例。Lauren分型：肠型31例，弥漫型27例。肿瘤直径≥5 cm 18例，直径＜5 cm 40例。

1.2 试剂及仪器

兔抗人AEG-1多克隆抗体 （ab45338） 与兔抗人CHD5多克隆抗体 （ab202132） 购自英国Abcam公司。兔SP检测试剂盒 （SP-9001） 及DAB显色液试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

采用免疫组化SP法，测定AEG-1和CHD5在胃癌组织及癌旁组织中的表达情况。标本石蜡块切片，所切标本在75 ℃恒温箱中放置6 h，取出后自然冷却。切片脱蜡、水合，3%过氧化氢溶液消除内源性过氧化物酶，置入高压水浴锅内的枸橼酸钠缓冲液中进行热修复，滴加山羊血清封闭液，静置20 min后，分别滴加AEG-1抗体 （1∶400） 与CHD5抗体 （1∶100） 。阴性对照滴加PBS溶液代替一抗，切片在4 ℃下过夜。复温、洗片后滴加二抗及辣根酶标记链霉卵白素，孵育后滴加显色液，冲洗、苏木素复染、脱水，最后用中性树胶盖片。

1.4 结果判定

由3名病理科医师在400倍的光学显微镜下随机观察5个视野，每个视野要求至少计数100个完整肿瘤细胞。肿瘤细胞胞质中出现棕黄色染色为阳性，以阳性细胞比例得分乘以染色强度得分为最终评判得分。在统计分析中，最终得分≥6分为高表达，＜6分为低表达。阳性细胞比例评分：＜5%为0分，5%～＜25%为1分，25%～＜50%为2分，50%～＜75%为3分，≥75%为4分。染色强度评分：未染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。

1.5 随访

随访自手术之日开始，术后第1、2年每3个月随访1次，术后3～5年每6个月随访1次。随访方式为门诊复查、电话和微信等方式，随访截止时间为2018年1月2日。

1.6 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。计数资料应用行×列联表的χ2检验；AEG-1与CHD5的相关性分析应用Spearman相关分析；生存曲线的绘制应用Kaplan-Meier法，其检验方法采用log-rank法；应用Cox比例风险回归模型对胃癌患者进行影响预后的多因素分析。P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织与其对应的癌旁组织中AEG-1与CHD5的表达

AEG-1的染色部位位于细胞质与细胞膜，见图1；CHD5的染色部位位于细胞质与少量细胞核，见图2。AEG-1在胃癌组织中与对应的癌旁组织中高表达率分别为74.14% （43/58）和37.93% （22/58）；CHD5在胃癌组织中与对应的癌旁组织中高表达率分别为32.76% （19/58）和70.69% （41/58） 。在胃癌组织中AEG-1的表达显著高于癌旁组织 （χ2=22.356，P ＜ 0.05） ，而CHD5在癌旁组织中表达明显高于胃癌组织 （χ2=16.710，P ＜ 0.05） ，差异有统计学意义。

2.2 AEG-1与CHD5蛋白表达与胃癌患者临床病例特征的相关性分析

AEG-1蛋白表达水平与患者的性别、年龄、分化程度、肿瘤直径大小无关 （P ＞ 0.05） ，而与患者的TNM分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、Lauren分型有关 （P ＜ 0.05） 。CHD5蛋白表达水平与患者性别、年龄、肿瘤直径大小、浸润深度、Lauren分型无关 （P ＞0.05） ，而与患者的分化程度、TNM分期、淋巴结转移上有关 （P ＜ 0.05） 。见表1。

图1 AEG-1的表达 ×400Fig.1 AEG-1 expression ×400

图2 CHD5的表达 ×400Fig.2 CHD5 expression ×400

2.3 胃癌组织中AEG-1与CHD5表达的相关性

胃癌组织中AEG-1高表达43例，低表达15例，CHD5高表达19例，低表达39例。两者均高表达7例，均低表达3例。Spearman相关分析结果显示，胃癌组织中AEG-1与CHD5蛋白表达水平呈现显著的负相关 （r = -0.595，P ＜ 0.001） ，见表2。

2.4 AEG-1与CHD5在胃癌患者中的表达与预后

53例患者随访时间为3～60个月，其中5例患者失访，随访率为91.38%。应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，AEG-1高表达组5年生存率为28.95%，AEG-1低表达组5年生存率为73.33%，见图3。Logrank检验结果显示，2组间差异有统计学意义（χ2=5.644，P = 0.018） 。CHD5高表达组5年生存率为77.78%，CHD5低表达组5年生存率为22.86%，见图4。log-rank检验结果显示，2组间差异有统计学意义 （χ2=7.643，P = 0.006） 。

2.5 Cox比例风险回归模型对胃癌患者生存率影响的多因素分析

应用Cox比例风险回归模型分析患者的年龄、性别、TNM分期、分化程度、有无淋巴结转移、Lauren分型、AEG-1表达情况和CHD5表达情况8个协变量，发现TNM分期、肿瘤分化程度、AEG-1表达情况与CHD5表达情况是影响胃癌患者预后的独立危险因素。见表3。

3 讨论

近年来，胃癌的肿瘤分子生物学研究发展迅速，科研人员力求从分子水平阐释胃癌侵袭、转移的发生机制，从而寻求合适的分子生物学指标进行预后评估或者靶向治疗［8-9］。在本研究中，AEG-1在胃癌组织中的高表达率为74.14%，显著高于癌旁正常组织。并且进一步研究发现，AEG-1的表达与患者的TNM分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、Lauren分型有关。因此，AEG-1的异常表达会影响肿瘤细胞增殖、侵袭等生物学行为。这与WU等［10］的研究结果一致。WU等［10］发现AEG-1的表达升高与胃癌的转移有关，并且AEG-1能够促进胃癌细胞的上皮-间质转化、迁移和侵袭。还有研究［11］发现，AEG-1在肿瘤坏死因子α的介导下易位到细胞核，与NF-κ B的p65亚基相互作用，并作为NF-κ B与转录机制间的桥接因子。这种相互作用增强了NF-κ B下游基因的转录，导致血管生成、侵袭和转移。

表1 胃癌患者AEG-1与CHD5在不同病理特征中的表达Tab.1 AEG-1 and CHD5 expressions in patients with different pathological characteristics of gastric cancer

表2 胃癌组织中AEG-1与CHD5表达的相关性（n）Tab.2 Correlation between AEG-1 and CHD5 expressions in gastric cancer（n）

CHD5是人类肿瘤中重要的抑癌基因，在染色质重塑过程中发挥重要作用［12］。本研究发现，CHD5在胃癌组织中呈现低表达，并且其表达情况与肿瘤分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关。因此，CHD5能够诱导肿瘤细胞发生增殖、侵袭、凋亡等行为，进而对肿瘤的发展产生影响。CHD5最重要的信号通路是ARF/P53，p53能够促进细胞凋亡机制的发生，并且起到稳定NF-κ B的转录而诱导细胞的凋亡的作用［13］。CHD5基因作为ARF/P53通路的上游基因，起到了重要的门户作用，一旦CHD5基因突变或缺失将引起其下游一系列靶基因功能丧失，从而导致肿瘤的发生发展［14］。AEG-1能够激活并促进NF-κ B信号通路进行转录，而CHD5则在上游抑制、稳定NF-κ B信号通路，这与本研究得出的相关分析结果相同，在胃癌组织中AEG-1与CHD5之间表达情况呈显著负相关 （r = -0.595，P ＜ 0.001） 。但本研究仍有不足，只探讨了AEG-1与CHD5在NFκ- B通路上的关系，在其他信号通路上的关系还尚不清楚，仍需深入研究。

图3 AEG-1表达水平与胃癌患者的预后关系Fig.3 Relationship between AEG-1 expression and gastric cancer prognosis

图4 CHD5表达水平与胃癌患者的预后关系Fig.4 Relationship between CHD5 expression and gastric cancer prognosis

表3 Cox比例风险回归模型对胃癌患者预后影响的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis of the prognosis of patients with gastric cancer by Cox proportional hazard regression model

通过随访和生存分析发现，AEG-1高表达组5年生存率明显低于低表达组，CHD5高表达组5年生存率高于低表达组。多因素分析发现，TNM分期、肿瘤分化程度、AEG-1与CHD5的表达情况是影响胃癌患者预后的独立危险因素。这些结果均提示AEG-1和CHD5与胃癌患者预后显著相关，有可能成为一种新的评估胃癌患者预后价值的标志物。

综上所述，胃癌的发生和发展受多种信号通路的影响，是一个复杂而又精密的过程。了解胃癌发生发展的机理，从根本上解决胃癌细胞在分化过程中的关键问题，是改善胃癌患者预后的重要途径。AEG-1和CHD5与胃癌的侵袭、浸润和转移关系密切，联合检测更有利于胃癌的早期诊断及预后判断，有望成为胃癌治疗的新靶点。