高水平表达SSU1的酿酒酵母菌构建

白 皓， 杜伟立， 路宏朝， 王 令， 张 涛

(陕西理工大学 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000)

亚硫酸盐转运蛋白(SSU1)属于TDT(Tellurite-resistance/dicarboxylate transporter family)家族[1]，以亚硫酸外流泵的形式结合于细胞膜，调节细胞内亚硫酸盐的外排[2-4]。一般来说，如果胞内亚硫酸盐浓度积累过高，亚硫酸盐不能及时排至胞外会导致胞内盐离子浓度过高，从而影响细胞代谢，造成细胞损伤等问题。在酿酒过程中SO2积累所转化的亚硫酸盐与膜受体结合会引起膜损伤[5]，细胞内容物外流，抑制ATP合成，同时亚硫酸还通过与酶或代谢产物结合的多个代谢途径[6]等多个水平影响微生物的活性，并由此导致细胞生长滞后、诱导孢子生成或细胞死亡等一系列异常表现，所以在酿酒业中酿酒酵母菌株对SO2耐受性的选择是一项重要的指标[7-8]。Avram等[9]研究了SSU1基因与FZF1转录因子之间的关系，发现FZF1的破坏导致亚硫酸盐的敏感性，并阐述了FZF1对SSU1基因具有正向调节作用。Nardi T等[10]对生长在不同环境下的酿酒酵母进行发酵试验，验证了SSU1基因所控制表达的亚硫酸盐转运蛋白可以调节亚硫酸盐代谢，进而证明酵母的SSU1基因可以促使亚硫酸外排，并是引起酵母菌株产生耐受性差异的主要原因之一。

为了进一步获得高水平表达亚硫酸盐转运蛋白的酿酒酵母菌株，本研究运用基因工程技术，构建多拷贝SSU1基因的酿酒酵母工程菌株，增加亚硫酸盐转运蛋白表达量，从而使其结合在细胞膜上并将亚硫酸盐排出细胞外，避免亚硫酸盐的积累对细胞的损伤。为生产实践中开发亚硫酸盐耐受性强的优良工程菌株提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

真核表达载体JMB440、酿酒酵母AH109和大肠杆菌E.coliTop10感受态细胞由陕西理工大学分子遗传研究室保存；RNA酶、Ex-Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ、蜗牛裂解酶和氨苄西林，购自宝生物工程(大连)有限公司。DL-2000 Marker、低分子质量蛋白标准，购自Thermo Fisher公司。质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒，购自BioFlux公司。基因序列测序和引物合成由北京奥科鼎盛生物有限公司完成。

1.2 实验方法

1.2.1 引物的设计

1.2.2 酿酒酵母SSU1基因的扩增

复苏及培养酿酒酵母AH109，采用珠磨法提取酵母基因组DNA。以基因组DNA为模板，以SSU1 F，R为引物，PCR扩增酿酒酵母SSU1基因，其PCR反应体系(50 μL)：Taq酶缓冲液5 μL，Mg2+6 μL，dNTP 5 μL，F，R引物各2 μL，模板1 μL，Taq酶0.3 μL，水28.7 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共34个循环；72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，DNA纯化试剂盒回收SSU1基因片段。

1.2.3 JMB440-SSU1真核表达载体的构建

BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切纯化SSU1基因片段和骨架载体JMB440，然后用T4连接酶将SSU1基因和JMB440连接，连接产物转化至E.coliTop10感受态细胞。以SSU1F，R为引物采用菌落PCR，BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切以及测序鉴定，获得重组载体JMB440-SSU1。

1.2.4 酵母转化以及SSU1基因表达检测

通过酵母一步转化法将表达载体JMB440-SSU1转化至酿酒酵母AH109，涂布于缺少亮氨酸的酵母营养缺陷型固体培养基(Synthetic Dropout Medium，SD)，30 ℃培养48 h。挑取酵母单克隆至3 mL无亮氨酸的SD液体培养基，在30 ℃，2000 r/min的摇床培养。以相同条件培养野生型AH109作为对照。当酵母培养液OD600(在600 nm处溶液的吸光值)约0.5 h，收集菌体，磷酸缓冲液(PBS)重悬，加SDS-PAGE上样缓冲液沸水浴10 min，冷冻离心取蛋白上清液，12% SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。

2 结果与分析

2.1 酿酒酵母SSU1基因的扩增

通过珠磨法提取高质量的酿酒酵母基因组DNA(图1)，以此DNA为模板，PCR扩增SSU1基因，其片段约为1600 bp，琼脂糖凝胶电泳显示与预期的SSU1基因目标片段1563 bp一致(图2)，由此可以证明成功获得SSU1基因片段。

M.DNA标准DL2000；1—3.酿酒酵母基因组DNA M.DNA标准DL2000；1—5.SSU1基因 图1 酵母基因组DNA检测结果 图2 SSU1基因扩增结果

图3 构建JMB440-SSU1

2.2 重组载体的鉴定

BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切纯化SSU1基因片段和骨架载体JMB440，然后用T4连接酶将SSU1基因和JMB440连接获得重组载体JMB440-SSU1(图3)，连接产物JMB440-SSU1转化至E.coliTop10感受态细胞于37 ℃过夜培养，挑取12个单克隆进行菌落PCR鉴定。经电泳检测，10个泳道均有单一清晰条带，其大小约为1600 bp，与SSU1基因长度1563 bp相一致(图4)；然后选取2，3号单克隆，提取质粒进行双酶切鉴定，结果表明能切出1600 bp的SSU1基因和骨架载体两条带，与预期的结果相一致(图5)。

2.3 序列比对及三维结构预测

将这两个阳性克隆测序，结果表明：SSU1基因准确地插入JMB440酵母表达载体，但是存在一个突变位点(图6)，其SSU1的活性不会受到影响。为了进一步了解SSU1的功能，本研究对SSU1蛋白三维结构预测，结果如图7所示：SSU1蛋白与阳性克隆蛋白进行比对，SSU1蛋白是由α螺旋和少量无规则卷曲组成的同型三聚体，无配体，结构简单，可能拥有更直接的功能作用。

M.DNA标准DL2000；1—12.单克隆菌落 M.DNA2000 Marker DL；1—2.两个单克隆提取的质粒双酶切鉴定图4 菌落PCR 图5 质粒酶切检测结果

P1-SSU1是质粒中SSU1基因序列；SSU1是NCBI中公布的基因序列图6 测序结果与SSU1基因序列比对

P1-SSU1是质粒中SSU1基因蛋白三维结构预测；SSU1是SSU1序列蛋白结构预测 M.蛋白质分子质量标准；1.空白对照菌株；2—3.工程菌株图7 阳性克隆预测蛋白与SSU1预测蛋白比对 图8 SDS-PAGE检测

2.4 SSU1表达鉴定

通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSU1基因表达，上样量20 μL。结果表明在约45 KD处有一条与预期的SSU1基因所表达的蛋白分子量相一致，但是实验组与对照组在相同水平下处理，其实验组蛋白表达量比对照组高(图8)。因此可以证明本研究成功构建能够高效表达SSU1基因重组酿酒酵母菌株AH109-JMB440-SSU1。

3 讨 论

SSU1蛋白是一种参与酿酒酵母亚硫酸盐代谢、调控亚硫酸盐外流的质膜蛋白[11]。在酵母细胞硫代谢过程中，SSU1基因编码的亚硫酸盐转运蛋白会以亚硫酸盐外流泵的形式锚定于细胞膜，当酵母细胞中亚硫酸盐过度积累，过量的亚硫酸盐可以通过亚硫酸盐外流泵从细胞内运输到细胞外，减少其对酵母细胞的毒害作用[12]。

研究发现，SSU1无效突变体相比野生型，能够积累更多的亚硫酸盐，而表达多拷贝SSU1的酵母细胞积累显著更少，同时多拷贝SSU1基因也能将一些不相关的亚硫酸盐敏感菌株的亚硫酸盐抗性提高3～8倍[13]。

本研究利用酵母表达载体可产生多拷贝基因的优势，成功构建了JMB440-SSU1重组真核表达载体，测序鉴定结果与NCBI公布的SSU1基因序列一致。同时发现SSU1基因存在较高的多态性，有利于酵母细胞的繁殖和代谢。然后将其转化至AH109菌株中，完成了对酿酒酵母的优化。通过成功构建高水平表达SSU1的优良酵母，一方面为获得亚硫酸盐耐受性强的优良工程菌株起到指导作用，另一方面也为酿酒酵母在其他基因方面的优化奠定理论基础。