高血压超重人群肠道菌群的研究

金 翎，崔 晓，蔡 军

血压升高是一个复杂的过程，受遗传学、人口学、共病、环境等多方面因素及相互之间作用的影响。最近的研究显示，肠道微生物菌群的紊乱与高血压的发病之间也有着非常强的关联性。如：16S rDNA测序发现高血压动物和高血压患者肠道微生物的丰度及多样性有所降低[1]；宏基因组测序发现盐敏感高血压大鼠和盐非敏感高血压大鼠的肠道菌群不同，且盐敏感高血压大鼠菌群紊乱与血压升高有关[2]。本课题组前期利用宏基因组和代谢组学对41名健康对照者，56例高血压前期患者及99例原发性高血压患者进行综合分析，在发现高血压前期患者和高血压患者肠道微生物变化的基础上，通过将高血压患者的粪菌移植至无菌小鼠体内的方式，明确了菌群紊乱与血压升高的因果关系[3]。

肥胖不仅与多种心血管事件（cardiovascular diseases, CVD）发病率的增加有关，如高血压、代谢综合征，同时，它也是心血管疾病发生的危险标志物和独立危险因素[4]。有证据表明，在超重和肥胖的成年人中CVD的发生风险增加，体质量减轻和血压的降低之间存在着直接的关系。据报道，高血压病人体质量减轻5%，可使得其收缩压降低3 mmHg，舒张压降低2 mmHg；且超重和肥胖的2型糖尿病患者经过4年5%体质量减轻后，与没有体质量减轻的对照组相比，服用的降压药量明显减少[5]。本研究拟探索高血压超重/肥胖人群的肠道菌群变化，以进一步揭示此类人群的发病机理，为高血压治疗提供理论依据。

1 对象及方法

1.1 对象 本研究共入组68例健康人和73例高血压患者，将高血压患者根据身高体质量指数（body mass index, BMI）进一步分为高血压体质量正常组和高血压超重/肥胖组。所有个体均来自45～60岁的“开滦研究”人群。排除标准：吸烟，进行降压治疗，有肿瘤、心力衰竭、肾功能衰竭、中风等疾病，或3个月内服用抗生素或益生菌。每位参与者均签署知情同意书。整个研究通过开滦总医院和阜外医院伦理委员会的伦理审核。

1.2 研究方法

1.2.1 临床检查和问卷调查 包括：吸烟、饮酒、生活方式、家庭病史、身体活动、已知疾病的诊断及治疗（高血压、冠心病、糖尿病、高脂血症、中风等）以及身高、体质量、腰围、臀围等测量，并计算BMI。BMI是衡量人体胖瘦程度和是否健康的常用指标。成年人的BMI处于18.5～25.0 kg/m2被认为是正常体质量；处于25.0～29.9 kg/m2被认为超重；超过30.0 kg/m2则被视为肥胖[6]。空腹血样生化检查项目包括血糖、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、TG、TC、CRP等。

参与者在测量血压前3 h禁止吸烟或喝咖啡、茶、酒精等，也禁止在测量血压前30 min进行任何运动。血压采用坐姿测量，用水银血压计对左上臂每隔5 min记录1次读数，共计3次，取其平均值作为最终的血压数据，若3个测量中的2个数值相差超过5 mmHg，则进行额外的测量。符合赫尔辛基宣言。根据国际高血压指南的标准JNC7，血压正常者的收缩压＜120 mmHg且舒张压＜80 mmHg，高血压者的收缩压≥140 mmHg或舒张压≥90 mmHg。

1.2.2 样品采集和DNA提取 无菌标本盒收集每个参与者的新鲜粪便样本≥2 g，立即于-80 ℃冷冻，然后用冰袋运送到实验室。用CTAB 裂解液和溶菌酶于65 ℃水浴中裂解粪便样品，离心取上清，用酚、氯仿、异戊醇和异丙醇抽提菌液DNA，并用75%乙醇洗涤沉淀。最终的DNA样品用双蒸水溶解。

1.2.3 宏基因组测序及Metagenome组装 检测合格的DNA样品用covaris超声破碎仪（covaris，美国）随机打断成长度约为350 bp的片段，经末端修复、加尾、加接头、纯化、PCR扩增等步骤完成对整个文库的构建。文库构建完成后，使用agilent 2100对文库中各插入片段大小进行检测，符合预期后，使用q-PCR的方法对文库有效浓度准确定量。当库检合格，文库的有效浓度＞3 nmol/L，在Illumina PE150平台进行测序。

因测序得到的原始数据存在一定比例的低质量数据，我们通过Readfq（V8）对原始数据进行质控及宿主过滤，去除质量阈值≤38的低质量碱基超过40 bp的片段、去除N碱基长度值≥10 bp的片段、去除与接头部分重叠超过15 bp的片段，以得到有效高质量的片段进行后续分析，确保信息分析结果的准确可靠。接着，将质控后的有效数据进行Metagenome组装，包括SOAPdenovo（V2.04）软件对有效数据的组装分析和SOAPdenovo（V2.04）/MEGAHIT（v1.0.4-beta）软件对各样品未被利用的片段混合组装。

1.2.4 基因预测及丰度分析 采用MetaGeneMark对各样品及混合组装长度≥500 bp的片段进行开放阅读框预测，用CD-HIT软件对预测结果去冗余。使用 Bowtie2软件将各样品的有效数据比对至初始基因目录，计算得到基因在各样品中比对上的片段数目。只有匹配片段≥2的基因才被列入考虑与样本相关。从比对上的片段数目及基因长度出发，计算得到各基因在各样品中的丰度信息。

1.2.5 物种注释和功能数据库注释 物种注释使用 DIAMOND软件，将各基因与NCBI的NR数据库中抽提出的细菌、真菌、古菌和病毒序列进行比对。对于每一条序列的比对结果，选取evalue≤最小evalue×10的结果，并采取最近公共祖先（lowest common ancestors, LCA）算法来确定该序列的物种注释信息。

常用功能数据注释采用DIAMOND软件，将各基因与eggNOG功能数据库进行比对。对于每一条序列的比对结果，选取最佳匹配结果进行后续功能分析。

1.3 统计学处理 用SAS 9.4软件进行统计分析。计量资料呈正态分布，用±s表示，2组间比较用成组t检验（组间方差齐）。2组间计数资料比较用四格表χ2检验或校正χ2检验或确切概率检验。使用Metastats分析组间物种差异和功能差异。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 高血压人群肠道菌群的种类和功能变化 本项目共入组68例健康人（血压正常组）和73例高血压患者（高血压组）。每组入选人的人口学及临床资料特征见表1。可以看到，除血压外其余指标2组间比较差异无统计学意义（P均＜0.05）。

使用 DIAMOND软件，将各基因与NR数据库中抽提出的细菌、真菌、古菌和病毒序列进行比对，并采取 LCA 算法来确定该序列的物种注释信息。根据菌群在属层级的相对丰度，我们选取组间Z分数有显著差别的细菌，绘制丰度信息热图，并使用Metastats分析组间物种差异。如图1所示，血压正常组和高血压组存在差异的菌群种类。如：高血压组的阴沟肠杆菌属细菌的丰度相对于血压正常组显著降低（P=0.018）；副杆菌属细菌的丰度则在高血压组中略有增多（P=0.042）。

为了进一步描述高血压对肠道微生物群功能的影响，我们根据样品在eggNOG数据库中的功能注释及丰度信息，选取丰度差异排名前 35 的功能并聚类。如图2所示，与血压正常组相比，高血压组菌群中整合酶家族、TonB依赖性受体、多肽酶、乙酰转移酶、组胺酸激酶等功能增强。

表1 参与者的人口学及临床特征Table 1 Demographic and clinical characteristics of all participants

2.2 超重/肥胖对高血压人群肠道菌群的种类和功能影响 肥胖作为心血管疾病发生的危险标志物和独立危险因素，与高血压发病率的增加有关。因此，我们依据BMI值，将高血压人群分为体质量正常组（BMI＜25.0 kg/m2）和超重 / 肥胖组（BMI≥25.0 kg/m2），以研究超重/肥胖对高血压人群肠道菌群的影响。2亚组的人口学及临床资料特征见表2，可以看到除BMI和高密度脂蛋白外其余指标2组间比较差异无统计学意义（P均＜0.05）。

图2 2组肠道菌群中功能相对丰度的聚类分析H.高血压组；C.血压正常组Figure 2 Cluster analysis of functional relative abundance of gut microbiota in 2 groups

表2 高血压组的人口学及临床特征Table 2 Demographic and clinical characteristics of hypertension group participants

通过DIAMOND软件，我们将各基因与NR数据库中抽提出的细菌、真菌、古菌和病毒序列进行比对，并采取 LCA 算法来确定该序列的物种注释信息。接着，根据菌群在属层级的相对丰度，我们选取组间Z分数有显著差别的细菌，绘制丰度信息热图，并使用Metastats分析组间物种差异。如图3所示，高血压体质量正常组和高血压超重/肥胖组存在差异的菌群，如：克雷伯菌属细菌、固氮螺菌属细菌、阿克曼属细菌和小杆菌属细菌在高血压超重/肥胖组的丰度相对于高血压体质量正常组显著升高，P值分别为0.015、0.046、0.022和0.004；高血压超重/肥胖组中副杆菌属细菌的丰度比高血压体质量正常组显著降低（P=0.046）。

我们从eggNOG数据库中选取菌群功能丰度差异排名前 35 的功能，并进行聚类。如图4A所示，与高血压体质量正常组相比，高血压超重/肥胖组肠道菌群中与转座酶、DNA结合蛋白、细胞膜、TonB依赖性受体、多肽酶等功能增强有关。利用 Metastats 方法对组间的菌群功能丰度数据进行假设检验。从不同层级的功能相对丰度表出发，将得到的P值进行校正，得到q值。我们发现，与序列特异性的DNA结合功能（ENOG4111N2I）、转录调节功能（ENOG4111Q2I）相关的菌群丰度在高血压超重/肥胖组中比高血压体质量正常组显著增加（q＜0.05）。

3 讨 论

本课题组前期利用宏基因组和代谢组学对41名健康对照者，56例高血压前期患者及99例原发性高血压患者进行综合分析，发现克雷伯肠道微生物在高血压前期患者中显著增多[3]。本研究对高血压人群队列进一步分析，发现此类菌在超重/肥胖组中丰度显著高于体质量正常组。

目前已有证据表明，除高脂高糖饮食、缺乏锻炼、家族性肥胖可导致肥胖外，人类肠道中的细菌与肥胖的产生也有直接关系[7]。C57BL/6无菌小鼠获得正常饲养动物的远端结肠微生物后，虽减少了食物摄入，但在14 d内其体脂肪含量和胰岛素抗性均增加了60%[8]。肥胖/超重可引起低度炎症、氧化应激、脂肪组织分泌改变等，进而促成高血压，所以被认为是血压升高的危险因素[9]。阴沟肠杆菌属于革兰阴性致病菌，被认为是造成肥胖的直接元凶之一，被冠以“肥胖细菌”的称号。研究发现当肥胖病态患者的体质量从初始的174.8 kg减轻到51.4 kg，并伴随有高血糖和高血压症状的恢复时，阴沟肠杆菌的相对丰度由35%降低到几乎检测不到；同时，将此肥胖患者的阴沟肠杆菌导入无菌小鼠并使用高脂高糖饲料喂养后，相对于对照组小鼠，其体质量迅速增加，体内多个器官也累积了更多的脂肪，并出现了胰岛素抵抗等肥胖症相关症状[7]。本研究还发现肠杆菌属细菌的丰度与血压也有一定相关性：高血压组肠杆菌属细菌丰度相对于血压正常组降低，但是有趣的是此菌丰度在高血压人群中的超重/肥胖组和体质量正常组中无显著差别。

图3 肠道菌群中Z分数有显著差异的细菌及它们在2组中的丰度信息H.N. 高血压体质量正常组；H.O. 高血压超重/肥胖组Figure 3 Gut bacteria with significant difference in Z score and their abundance in different groups

图4 2组肠道菌群中功能相对丰度的聚类分析H.N. 高血压体质量正常组；H.O. 高血压超重/肥胖组Figure 4 Cluster analysis of functional relative abundance of gut microbiota in 2 groups

副杆菌属细菌是拟杆菌门的一个菌属，与肠道疾病关系密切。据报道，相较于溃疡性结肠炎患者，正常人肠道中副杆菌属细菌表达水平较高，提示该菌群的缺失与溃疡性结肠炎的发生有关[10]。最近研究发现，Parabacteroides goldsteinii类肠杆菌可以抑制高脂饲料喂养小鼠的肥胖和代谢紊乱，维持肠道完整性，降低内毒素血症和炎症。该细菌已被证实与肥胖呈负相关关系[11]。而本研究也发现副杆菌属细菌在高血压超重/肥胖组中丰度则显著低于高血压体质量正常组。

据报道，肠道菌群的改变会影响心血管系统的代谢，可以为心血管疾病的治疗带来新的突变[12]，菌群的改变对于改善患者的高血压或者超重/肥胖状态也起到一定的作用。高血压大鼠模型及人类临床试验Meta分析均显示，给予益生菌可以降低血压[13-14]。同时，通过抗生素抑制肥胖小鼠的肠道细菌后，可以明显改善其糖耐量和胰岛素抵抗[15]。这提示我们，通过有效的干预措施可改变高血压超重/肥胖人群微生物菌群组成，进而影响其体质量和血压。

本研究还存在一定的局限性。首先，入选队列人群来自“开滦研究”。“开滦研究”是一项在河北省唐山市开滦社区进行的前瞻性队列研究，由开滦集体管理。2006年6月—2007年10月期间，共有101 510名居民（81 110名男性和20 400名女性，年龄在18～98岁）被邀请参加“开滦研究”，超过95%的参与者为汉族人[16]。因此，本研究人群仅包含了中国北方某一地区的汉族人群。其次，由于参与者严格控制年龄及排除标准，所以入选的人数有限。这对研究结果的普遍性具有一定的影响，还须后续的大样本研究加以证实。另外，菌群和高血压超重/肥胖之间的因果关系须要通过菌群移植实验进一步验证。