Fyn与小鼠肝纤维化模型中胆汁酸代谢组分的相关性研究

杜桂芳，董金珂，张 婷，杨新瑞，卢姗姗，曲建慧，陆荫英，洪智贤

肝纤维化是肝脏弥漫性细胞外基质过度沉积，汇管区纤维结缔组织增生的病理改变[1]。目前已知在慢性炎症诱导的肝脏持续损伤修复过程中，肝脏代谢网络会发生显著变化，进而影响到机体内众多的内源性小分子代谢物及其上下游生物学通路功能，而紊乱的代谢通路反过来又会加重炎症相关肝纤维化的进程和转归，形成恶性循环[2-3]。胆汁酸（bile acids, BAs）是胆汁中一类胆烷酸的总称，可直接反应肝脏的代谢功能状态[4]。在肝脏病理状态下，BAs代谢障碍，表现为患者血清中BAs水平增高、组成比例失衡；而异常的BAs代谢产物可通过影响免疫细胞、肝细胞的功能及肠道菌群等来反馈调节BAs的肠肝循环及肝病进程[5]。Src激酶的活化可以影响分子渗透相关信号通路，进而影响渗透依赖的BAs的合成[6]，也有助于BAs穿过胆小管膜和BAs的转运[7]。Fyn为Src激酶家族的重要成员之一，可以介导高渗透压诱导的膜转运蛋白Mrp2 和Bsep的回运，进而促进BAs的回流和胆汁淤积[8]。本研究检测了四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化小鼠血清中BAs各组分含量的变化，并在此基础上，初步探索其相关的分子机制。

1 对象与方法

1.1 CCl4诱导小鼠肝纤维化模型的建立 实验动物为6周龄的C57BL/6小鼠，SPF级，雄性，18～20 g[购自常州卡文斯实验动物有限公司，动物合格SCXK（苏）2011-0003，NO.201607595]。将实验动物分为健康组和肝纤维化组，每组5只小鼠。正常喂养健康组小鼠，不进行操作；对肝纤维化组小鼠从第1周开始腹腔注射10%CCl4（橄榄油配制），注射体积2 ml/kg，每周3次，共6周，形成肝纤维化进行后续的检测。

1.2 血清和肝脏标本的制备

1.2.1 血清制备 6周后，对小鼠进行摘眼球取血，血液室温静置30 min，3000 rpm，离心20 min，吸取上清，-80 ℃冻存。

1.2.2 肝脏处理 取出小鼠肝脏拍照、称重，然后剪取左肝叶放入冻存管中，立即置于液氮中，然后放置于-80℃冰箱用于提取蛋白、RNA及细胞因子测定。剩余肝脏在磷酸盐缓冲液中清洗2次后，放入50 ml 离心管中用多聚甲醛溶液浸泡固定，用于石蜡切片。

1.3 小鼠肝纤维化程度的评估

1.3.1 血清ALT和透明质酸的检测 将小鼠血清用0.9%NaCl溶液稀释5倍，送至解放军第三〇二医院检验科检测ALT和透明质酸。

1.3.2 病理检测 用HE染色、Masson染色和Cordon-Sweet 网状纤维染色检测肝脏组织的损伤和纤维化程度。

1.4 BAs检测 用液相色谱-质谱联用仪（liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS）检测血清中BAs各组分的含量

1.4.1 色谱条件 柱温为40 ℃；流速为0.4 ml/min；流动相为A：水+0.1%甲酸+10 mmol/L乙酸胺；B：80%甲醇+20%乙腈+0.1%甲酸。

1.4.2 质谱条件 喷雾电压2.0 kV；毛细管温度275 ℃；S-lens 55%；碰撞能量 27% HCD；分辨率设置一级70 000@m/z 200，二级17 500@m/z 200；母离子扫描范围m/z 300～1800；子离子扫描范围start from m/z 100。

1.4.3 标准品储备液配制 适量粉末溶于水-乙腈-异丙醇溶液 （水∶乙腈∶异丙醇=10∶6∶5），配制成浓度为10 mg/ml溶液；氯磺丙胺标准品储备液：适量粉末溶于甲醇，配制成浓度为10 mg/ml甲醇溶液。

1.4.4 血清样品处理 -80 ℃低温保存的干燥后样品，4 ℃解冻。定量称取约50 μl于离心管中，加入 0.5 μg/ml内标溶液 10 μl，冷蛋白沉淀液300 μl，涡旋 45 s，4 ℃下，以 16 000 g/min，离心10 min，取上清液200 μl，吹干。用甲醇50 μl复溶，进样 5 μl。

1.4.5 数据处理 参照BAs标准品数据库，用PeakView1.2软件将样品中的BAs定性，用MultiQuant2.1 对定性的BAs定量，用样品中的内标校正后，用标准曲线计算相应浓度。

1.5 仪器和试剂

1.5.1 仪器 LC/MS所用仪器为Eksigent LC100和AB SCIEX Triple TOF 5600+（Waters，美国）；色谱柱为 Waters XBridge Peptide BEH C18 3.5 μm，2.1 mm×100.0 mm（Waters，美国）；预柱为Phenomenex C18，4 mm×20 mm（Waters，美国）。

1.5.2 试剂 CCl4、橄榄油、苏木精、伊红等均购自国药集团化学试剂有限公司，0.9%氯化钠注射液购自四川科伦药业股份有限公司；BAs标准品均购自Sigma公司；Western Blot所用anti-Fyn抗体（货号：sc-434）购自santa-cruz公司，antiα-SMA抗体（货号：ab5694）购自abcam公司，anti-GAPDH抗体（TA-08）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.6 统计学处理 用SPSS 17.0 处理数据。计量资料呈正态分布，以±s表示，2组间比较用成组t检验（组间方差齐）。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠纤维化程度的病理评估 肝纤维化形成的判断依据为肝脏表面不光滑，HE染色显示肝脏组织中多数中央静脉区和汇管区出现炎症、多个点/灶坏死、存在肝细胞水样变性（图1箭头所示），网状纤维染色显示肝脏出现大量纤维组织增生（图1箭头所示）。肝纤维化小鼠经过6周的CCl4诱导，每只个体均达到肝纤维化标准，相对于健康组，诱导后小鼠血清中透明质 酸 [（435.0±62.9）μg/L vs. （1124.0±328.6）μg/L，t=0.405，P=0.002]和 ALT[（41.0±15.2）U/L vs.（227.0±41.0）U/L，t=9.512，P=0.000]的 含 量显著升高。以上结果说明小鼠肝纤维化模型诱导成功。

2.2 BAs代谢谱分析 取血清样本，运用LCMS/MS代谢组学研究技术平台检测BAs代谢情况，结果显示：肝纤维化造模后，小鼠血清中BAs各组分普遍升高。相对于健康组，肝纤维化组中鹅去氧胆酸（chenodeoxycholic acid, CDCA）[（0.063±0.017）ng/ml vs.（0.145±0.013）ng/ml，t=8.568，P=0.000]、去氧胆酸（deoxycholic acid,DCA）[（0.312±0.014）ng/ml vs.（0.987±0.241）ng/ml，t=6.252，P=0.000]、 牛 磺 -β-鼠 胆 酸（tauro-βmuricholic, T-βMCA）[（0.501±0.114）ng/ml vs.（1.735±0.476）ng/ml，t=5.637，P=0.000]、熊 去 氧 胆 酸（ursodeoxycholic acid, UDCA）[（0.042±0.013）ng/ml vs. （0.187±0.035）ng/ml，t=9.512，P=0.000]、α-鼠 胆 酸（α-muricholic acid, α-MCA）[（0.131±0.050）ng/ml vs.（1.004±0.345）ng/ml，t=5.600，P=0.001]、β-鼠 胆 酸（β-muricholic acid, β-MCA）[（0.324±0.104）ng/ml vs.（1.598±0.302）ng/ml，t=8.919，P=0.000]显著升高，差异有统计学意义（图2）。

图1 小鼠肝纤维化病理图片Figure 1 Pathological picture of liver fibrosis of mice

图2 2组BAs代谢谱组分比较Ctrl.健康组；CCl4.肝纤维化组；横标目均为组别；*. P＜0.05Figure 2 Comparison of bile acids metabolic components between 2 groups

2.3 小鼠肝脏组织中Fyn表达量与肝纤维化的关系 提取小鼠肝脏组织全蛋白组，运用Western Blot检测Fyn的表达情况，结果显示：相对于健康对照组，肝纤维化造模后小鼠肝脏组织中 α-SMA[（1.000±0.155）vs.（4.496±1.052），t=7.352，P=0.000）]与 Fyn[（1.000±0.270 ）vs.（1.954±0.534），t=3.565，P=0.007）]的 表达量显著升高，差异有统计学意义（图3）。

图3 小鼠肝脏组织中Fyn表达量与肝纤维化的关系GAPDH. 内参蛋白Figure 3 Correlation between Fyn expression level and liver fibrosis of mice

图4 Fyn表达量与血清中BAs代谢组分的相关性分析Fyn表达量为灰度值，无单位Figure 4 Correlation analysis between Fyn expression and metabolic components of BAs in serum

2.4 Fyn表达量与血清中BAs代谢组分的相关性分析 小鼠肝脏中Fyn的表达量与血清中UDCA （r=0.761，P=0.011）、DCA（r=0.789，P=0.007）、牛磺熊去氧胆酸（tauroursodeoxycholic acid, TCDCA）（r=0.799，P=0.006）的浓度呈正相关，差异具有统计学意义（图4）。

3 讨 论

在BAs合成的经典途径中，肝细胞内胆固醇在限速酶胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）的作用下生成7α-固醇继而转化成初级BAs：胆酸及CDCA，它们与牛磺酸或甘氨酸结合后随胆汁进入胆管，流入肠道，在肠道内受细菌作用转化成相应的次级BAs：UDCA、石胆酸（lithocholic acid,LCA）/鼠胆酸（小鼠特有）及DCA等；替代途径则是在限速酶氧化甾醇27α羟化酶（CYP21A1）的作用下生成次级BAs。约95%的次级BAs被肠道重吸收，经门静脉重新回到肝脏，与新合成的结合BAs一起再经过胆道排入肠道，称为“BAs的肝-肠循环”。 在生理状态下，上述过程受到一系列正、负反馈机制和多种信号通路的精细调节[9]。既往研究表明，在HCV导致的肝纤维化患者中，纤维化程度与血清中BAs水平呈正相关关系[10]。在HBV导致的肝硬化患者中，血清5种BAs： 甘氨胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、TCDCA及甘氨熊去氧胆酸的动态水平与肝纤维化的不同阶段（Child-Pugh分期A～C期）显著相关，血清BAs的动态变化是表明肝功能恶化程度、肝硬化分期、监测肝硬化进展的潜在重要标志物[11]。在胆汁淤积型患者中，血清中LCA和DCA的减少、血清硫化BAs增加与胆汁淤积程度相关[12]。

我们的研究发现，利用CCl4诱导C57BL/6小鼠形成肝纤维化后，运用LC-MS/MS代谢组学研究技术平台检测BAs代谢情况，血清中BAs各组分普遍升高，其中肝纤维化组中CDCA、DCA、T-βMCA、UDCA、α-MCA、β-MCA 相对健康组有显著升高。其中CDCA能被用来治疗BAs缺乏的患者，UDCA是一种高度可溶的和无毒的BAs，已被FDA批准用于胆石溶解和治疗原发性胆汁性肝硬化，而DCA具有高毒性，并且会促进结肠癌的发生[9]。文献报道，Src 激酶家族在BAs转运和合成过程中起重要的作用：Src激酶的活化可以影响分子渗透相关信号通路，进而影响渗透依赖的BAs的合成[6]，也有助于BAs穿过胆小管膜和BAs的转运[7]。Fyn为Src激酶家族的重要成员之一，Fyn可以介导高渗透压诱导的膜转运蛋白Mrp2 和Bsep的回运，进而促进BAs的回流和胆汁淤积[8]。我们的研究发现，Fyn在肝纤维化组小鼠肝脏中的表达量显著高于健康组，并且Fyn的表达量也显著升高并且与血清中UDCA、DCA、TCDCA的含量呈正相关的关系。根据以上结果，我们推测Fyn在BAs合成和转运过程中可能扮演重要的角色，进而影响肝纤维化的形成，但其具体机制还有待探索。因此，以Fyn及BAs转运调控途径为靶点进行抗肝纤维化药物的开发具有潜在的临床应用价值。

我们的研究明确了CCl4诱导小鼠肝纤维化模型中BAs代谢谱的改变，并初步探索了BAs合成与转运的分子机制。全面深入地了解肝纤维过程中BAs代谢组分的变化规律及调控机制，不但有助于阐明其在肝脏慢性炎症及纤维化过程中的生物学作用，还有望找到影响肝纤维化进程的关键靶点，开发抗肝纤维化药物[13]。然而，关于肝纤维化形成分子机制和BAs代谢组学的研究还存在很多未知，我们在今后的研究中将继续探索，为肝纤维化的诊疗寻找更多的理论依据。