反相高效液相色谱法测定防己黄芪汤中6种活性成分的含量

关 皎，张 颖，费 雪，孙宇慧，王黎明，郝乘仪，冯 波，朱鹤云

(吉林医药学院药学院,吉林 吉林 132013)

防己黄芪汤出自汉代张仲景所著的《金匮要略》，原文记载“风湿，脉浮身重，汗出恶风者，防己黄芪汤主之；风水，脉浮身重，汗出恶风者，防己黄芪汤主之”[1]。该方由防己、黄芪、白术、甘草组成，在临床应用中常加入生姜和大枣，具有益气祛风、健脾利水的功效。研究表明，防己黄芪汤具有抗炎、镇痛、抗氧化、利尿、降血脂等多种生物活性，广泛用于关节炎症、水肿、肾脏疾病和肺部疾病的治疗[2-4]。

防己黄芪汤的配方体现“治水必治气，气行则水行，气伏则水伏”的思想，方中防己、黄芪共为君药，白术为臣药，甘草、生姜、大枣共为佐使药。防己配伍白术祛风利水除湿，配伍黄芪益气固表补虚；防己得黄芪可加强利水湿之功，黄芪得白术增益气之力；甘草、生姜、大枣调和营卫，助力黄芪益气固表之效[5]。防己中主要含有粉防己碱和防己诺林碱等生物碱类成分，具有祛风湿、止痛、利水消肿等功效[6]；黄芪中主要含有毛蕊异黄酮等黄酮类成分和黄芪甲苷等皂苷类成分，具有增强免疫力、促进血液循环等功效[7]；白术中主要含有白术内酯Ⅰ等内酯类成分，具有健脾益气、调节胃肠运动、抗炎等功效[8]；甘草中主要含有甘草酸等三萜类成分和甘草苷等黄酮类成分，具有抗炎、抗溃疡、抗过敏等功效[9]。目前，针对防己黄芪汤组方中各单味药的质量控制已有大量文献报道[10-14]，但关于防己黄芪汤质量控制的报道较少[15-16]，而且这些方法存在分析时间较长、检测指标少、样品处理复杂等缺点。本研究采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法在同一流动相下采用两种洗脱方法测定防己黄芪汤中的6种活性成分(粉防己碱、防己诺林碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸和白术内酯Ⅰ)的含量，为全面评价防己黄芪汤的内在质量提供科学依据。

1 仪器与试药

LC-20A型高效液相色谱仪(配备Prominence SIL-20AHT自动进样器，LC-20AT二元泵，CTO-20A柱温箱，SPD-20A紫外检测器，LC solution色谱工作站，日本岛津公司)；KQ-250DE型数控声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CPA 225D型电子天平(德国赛多利斯仪器有限公司)；FW80微型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；R-3型旋转蒸发仪(瑞士步琦)；SHB-Ⅲ循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；98-1-C型数字控温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；XK96-A快速混匀器(江苏新康医药器械有限公司)。

乙腈和甲醇为色谱纯(美国Fisher科技)，甲酸和醋酸铵为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)，所用水为经过Milli-Q型超纯水仪净化后的超纯水，其他试剂均为分析纯。对照品粉防己碱(批号：110711-201609)、防己诺林碱(批号：110793-201606)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号：111920-201606)、甘草苷(批号：111610-201607)购自中国食品药品检定研究院，对照品甘草酸(批号：151014)和白术内酯Ⅰ(批号：160321)购自成都普菲德生物技术有限公司，纯度均大于98%。

粉防己、黄芪、白术、炙甘草、大枣、生姜分别购自吉林市吉林大药房，产地分别为江西、甘肃、浙江、内蒙、新疆、吉林，经吉林医药学院生药教研室李景华副教授鉴定为防己科植物粉防己StephaniatetrandraS.Moore的干燥根，豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根，菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根茎，豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根茎的炮制品，鼠李科植物枣ZiziphusJujubaMill.的干燥成熟果实，姜科植物姜ZingiberofficinaleRose.的新鲜根茎。样本留存于吉林医药学院药学院中药样品室。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18(2)柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为0.2 mol/L乙酸铵0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为20 μL。

测定粉防己碱、防己诺林碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸时采用梯度洗脱(0～5 min，15%～20%B；5～10 min，20%～30%B；10～15 min，30%～35%B；15～20 min，35%～45%B，V/V)；检测波长为254 nm。典型色谱图见图1。测定白术内酯Ⅰ时采用等度洗脱(0～8 min，80%～80%B，V/V)，检测波长为220 nm。典型色谱图见图2。

2.2 防己黄芪汤的制备

参照《金匮要略》原文，折合成现代剂量，分别称取防己12 g、黄芪15 g、白术9 g、炙甘草6 g，加入生姜4片和大枣1枚，置于1 L圆底烧瓶中，加入10倍量水浸泡0.5 h，回流提取1 h，放冷过滤，滤渣再加入10倍量的水回流提取1 h，放冷过滤。最后合并2次滤液，浓缩至50 mL，置于4 ℃冰箱中保存备用。

2.3 溶液的制备

2.3.1对照品溶液的制备

取粉防己碱、防己诺林碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸对照品适量，精密称定，置于5 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，制成含粉防己碱、防己诺林碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸均为1.0 g/L的单一对照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存备用。取白术内酯Ⅰ对照品适量，精密称定，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，制成含白术内酯Ⅰ为0.1 g/L的对照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存备用。

2.3.2供试品溶液的制备

取“2.2”项下防己黄芪汤提取液1 mL，置50 mL锥形瓶中，加70%甲醇溶液25 mL，称重，超声提取30 min，放冷后再称重，用70%甲醇补足缺失的重量，摇匀，滤过，取续滤液经0.22 μm微孔滤膜过滤后作为供试品溶液。

2.3.3阴性样品溶液的制备

按处方量分别制备不含防己的阴性样品溶液、不含黄芪的阴性样品溶液、不含甘草的阴性样品溶液和不含白术的阴性样品溶液，按“2.3.2”项方法操作，即得。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.3.1”项下粉防己碱、防己诺林碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸对照品溶液适量，置于5 mL量瓶中，用甲醇-水(70∶30,V/V)配制成粉防己碱、甘草苷和甘草酸浓度为5、10、25、50、100、250 mg/L，防己诺林碱和毛蕊异黄酮葡萄糖苷浓度为1、2、5、10、20、50 mg/L的系列对照品溶液，依次注入液相色谱仪，测定色谱峰面积，以对照品的浓度X(mg/L)为横坐标，色谱峰面积积分值(Y)为纵坐标，进行线性回归，粉防己碱、防己诺林碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸的回归方程分别为：

Y=7.1×103X-8.0×103R=0.999 9

Y=9.0×103X+2.7×103R=0.999 9

Y=5.5×104X+4.3×104R=0.999 6

Y=1.4×104X+3.1×104R=0.999 6

Y=1.8×104X+2.1×104R=0.999 9

结果表明，粉防己碱、防己诺林碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸分别在5～250 mg/L(R=0.999 9)、1～50 mg/L(R=0.999 9)、1～50 mg/L(R=0.999 6)、5～250 mg/L(R=0.999 6)、5～250 mg/L(R=0.999 9)浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密吸取“2.3.1”项下白术内酯Ⅰ对照品溶液适量，置于5 mL量瓶中，用甲醇-水(70∶30,V/V)配制成浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5 mg/L的系列对照品溶液，依次注入液相色谱仪，测定色谱峰面积，以所含对照品的浓度X(mg/L)为横坐标，色谱峰面积积分值(Y)为纵坐标，进行线性回归，白术内酯Ⅰ的回归方程为：

Y=6.3×105X+1.0×106R=0.999 6

结果表明，白术内酯Ⅰ在0.05～2.5 mg/L浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度实验

取“2.4”项下制备的粉防己碱、防己诺林碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸第4混合对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果粉防己碱、防己诺林碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸峰面积的RSD(n=6)分别为2.6%、1.9%、2.4%、2.6%和2.6%，表明仪器精密度良好。

取“2.4”项下制备的白术内酯Ⅰ第4对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果白术内酯Ⅰ峰面积的RSD(n=6)为1.9%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验

取同一批次的供试品溶液，放置于室温，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录峰面积。结果粉防己碱、防己诺林碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸峰面积的RSD(n=6)分别为0.7%、0.4%、0.4%、0.3%和0.2%；白术内酯Ⅰ峰面积的RSD(n=6)为2.2%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性实验

取同一批样品6份，精密称定，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，分别计算粉防己碱、防己诺林碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸的含量，结果上述5种成分的含量的平均值(n=6)分别为1.343、0.367、0.136、0.743、0.804 mg/L，RSD分别为1.3%、1.9%、0.4%、0.3%和0.3%；白术内酯Ⅰ含量的平均值(n=6)为0.002 2 mg/L，RSD为1.8%，表明方法重复性良好。

2.8 回收率实验

精密称取已知含量(粉防己碱、防己诺林碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸和白术内酯Ⅰ的含量分别为1.343、0.367、0.136、0.743、0.804、0.002 2 mg/L)的防己黄芪汤样品溶液共9份，每份0.5 mL，精密称定，分别加入相当于样品中粉防己碱、防己诺林碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸和白术内酯Ⅰ含量的80%、100%、120%的对照品溶液适量，各3份。按“2.3.2”项下的方法制备供试品溶液，进样20 μL测定，计算粉防己碱、防己诺林碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸和白术内酯Ⅰ的回收率和RSD，结果见表1。

表 1 防己黄芪汤样品中各成分的回收率

2.9 样品含量测定

制备6批防己黄芪汤供试品溶液，进样20 μL，记录峰面积，代入回归方程，计算粉防己碱(A)、防己诺林碱(B)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(C)、甘草苷(D)、甘草酸(E)和白术内酯Ⅰ(F)的含量。6批样品测定结果见表2。

3 讨 论

3.1 流动相的优化

分别考察了乙腈-0.2 mol/L乙酸铵0.1%甲酸溶液、甲醇-0.2 mol/L乙酸铵0.1%甲酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.01%三乙胺水溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液(70∶30)(三乙胺调pH至8)、乙腈-0.2%甲酸溶液和乙腈-水(60∶40)共7种流动相体系。结果表明，采用乙腈-0.2 mol/L乙酸铵0.1%甲酸溶液作为流动相时能够获得较好的分离效果，在该流动相条件下，白术内酯Ⅰ的分析时间为8 min，粉防己碱、防己诺林碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸的分析时间为20 min。与文献[15]相比分析时间明显缩短，且药材中其他色谱峰不干扰样品的测定。

表 2 6批样品测定结果(g/L)

3.2 检测波长的选择

一般测定含量时会选择化合物的最大吸收波长为检测波长。由于本实验需要测定多个最大吸收波长不同的化合物，需要选择可同时兼顾到多种测定成分的波长进行检测。综合考虑杂峰影响，基线平稳，色谱峰峰形，最大吸收等因素，最后确定220 nm和254 nm分别作为白术和其他5种成分的检测波长。

3.3 提取方法及提取溶剂的选择

本实验对比了超声法、回流法、水浴蒸干复溶法、固相萃取法共4种提取方法，结果发现，超声法出峰效果较好，受杂峰影响小，因此选择超声法作为防己黄芪汤的提取方法。此外，本实验对比了50%、70%、100%乙腈溶液，50%、70%、100%乙醇溶液和50%、70%、100%甲醇溶液作为提取溶剂对防己黄芪汤中活性成分的提取效率，结果显示70%甲醇的综合提取效率最高，故本实验采用70%甲醇作为提取溶剂。

中药复方具有化学成分复杂、含量差异大等特点，建立符合中药复方特点的专属、灵敏的质量控制方法是当前中药药效物质基础研究的瓶颈和难点。本实验采用RP-HPLC法测定防己黄芪汤中粉防己碱、防己诺林碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸和白术内酯Ⅰ共6个活性成分的含量，分离度高，操作简便，结果准确，重复性好，分析时间短，可为防己黄芪汤的质量标准提升提供依据。