酶法提取女贞子多糖及其抗氧化性研究

周 旋，马 鹏,蔡 瑜，霍明洋，王兆卫，翟晓瑞，郗艳丽

(吉林医药学院公共卫生学院,吉林 吉林 132013)

女贞子为木犀科常绿乔木植物女贞(LigustrumlucidumAit.)的干燥成熟果实[1]。研究表明女贞子主要含有多糖、黄酮类、萜类、苷类、色素、挥发油类等活性成分[2-3]。多糖是天然高分子化合物[4]，具有抗氧化[5]、抗肿瘤[6]、降血糖、降血脂[7]、抗病毒、抗凝血[8]、防治骨质疏松[9-10]以及提高免疫力[11]等多种生物活性,广泛应用于药物、医疗和功能食品中。探究女贞子多糖的提取率和质量对进一步开发女贞子资源具有十分重要的意义。本实验以女贞子为研究对象，采用纤维素酶法提取女贞子多糖，运用单因素实验和正交试验优化提取工艺，并对其进行体外抗氧化活性研究，为女贞子的开发利用提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与设备

女贞子：产地河北；葡萄糖：北京化工；硫酸、无水硫酸铜和盐酸：上海德榜化工有限公司；苯酚：天津市永大化学试剂有限公司；邻苯三酚和无水乙醇：天津大茂化学试剂厂；Tris：上海基星生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)和纤维素酶：Sigma公司；柠檬酸和柠檬酸钠：西陇化工股份有限公司；L-抗坏血酸：生工生物工程股份有限公司。

BS224S电子天平：北京赛多利斯；多功能粉碎机：中南制药机械厂；漩涡混匀器：北京大龙；GFL-230鼓风干燥箱：天津莱玻特瑞；722型分光光度计：上海菁华科技有限公司；5810R低速离心机：艾本德公司；S220-BiopH计：梅特勒；DK-S26水浴锅：上海精宏；AP-9901S无油真空泵：天津特赛恩斯仪器有限公司。

1.2 提取工艺流程

将女贞子恒温烘干，粉碎过60目筛，干燥备用。称取一定量的女贞子样品，加入一定pH值的酶溶液，充分混匀后按一定的提取条件(酶解时间、酶解温度、酶量和pH值)提取，沸水浴灭活，抽滤，定容，得女贞子总糖的提取液。

1.3 葡萄糖标准曲线的绘制

配置浓度为0、20、40、60、80和100 mg/L的葡萄糖标准溶液，吸取0.5 mL各浓度标准溶液于试管中，分别加入1.0 mL的苯酚溶液(质量浓度浓度为5%)和5.0 mL的浓硫酸，混匀后40 ℃水浴30 min，流水冷却，在490 nm处测定其吸光度。平行3组试验，以3组吸光度A平均值为纵坐标，以3组标准品质量浓度平均值为横坐标，绘制标准曲线。

1.4 女贞子多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定提取液总糖的含量，计算多糖提取率。

1.5 女贞子多糖提取的单因素实验

1.5.1酶解时间对女贞子多糖提取率的影响

准确称取1.0 g女贞子干粉，按1∶40(g/mL)料液比加入pH值为5.2柠檬酸钠缓冲溶液30 mL，按酶量0.6%分别加入纤维素酶，50 ℃反应30、60、90、120、150 min。待反应结束，立即于沸水浴中灭活10 min，抽滤，取滤液测定吸光度，计算提取率。

1.5.2酶解温度对女贞子多糖提取率的影响

准确称取1.0 g女贞子干粉，按1∶40(g/mL)料液比加入pH值为5.2柠檬酸钠缓冲溶液30 mL，按酶量0.6%分别加入纤维素酶，30、40、50、60、70 ℃反应90 min，待反应结束，立即于沸水浴中灭活10 min，抽滤，取滤液测定吸光度，计算提取率。

1.5.3酶量对女贞子多糖提取率的影响

准确称取1.0 g女贞子干粉，按1∶40(g/mL)料液比加入pH值为5.2柠檬酸钠缓冲溶液30 mL，按酶量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%分别加入纤维素酶，50 ℃反应90 min。待反应结束，立即于沸水浴中灭活10 min，抽滤，取滤液测定吸光度，计算提取率。

1.5.4pH值对女贞子多糖提取率的影响

准确称取1.0 g女贞子干粉，按1∶40(g/mL)料液比加入pH值为4.4、4.8、5.2、5.6、6.0柠檬酸钠缓冲溶液30 mL，按酶量0.6%分别加入纤维素酶，50 ℃反应90 min。待反应结束，立即于沸水浴中灭活10 min，抽滤，取滤液测定吸光度，计算提取率。

1.6 女贞子多糖提取的正交试验

在单因素试验基础上，运用L9(34)正交表，以多糖提取率为评价指标，选择酶解时间、酶解温度、酶量、pH值做4因素3水平试验，每组试验平行操作3次取平均值作为最终提取率。因素水平设计见表1。

表 1 正交试验因素水平表

1.7 抗氧化试验

1.7.1清除DPPH·自由基能力的测定

精确称取19.7 mg的DPPH，用无水乙醇定容到250 mL容量瓶中，充分混匀。将提取的女贞子多糖配置成不同梯度浓度的待测样品溶液。多糖溶液与DPPH溶液或无水乙醇溶液按1∶1混合，避光反应30 min，517 nm波长测定吸光度，以上各管均做3组平行。计算对DPPH·自由基的清除率,并以L-抗坏血酸做阳性对照[12]。

1.7.2清除羟自由基能力的测定

取1 mL不同浓度的多糖溶液，加入9 mmol/L FeSO41 mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1 mL、8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL，经37 ℃水浴反应0.5 h后，于510 nm下测定吸光度，以上各管均做3组平行。计算对羟自由基的清除率，并以L-抗坏血酸做阳性对照[13]。

1.7.3清除超氧阴离子自由基的能力测定

取Tris-HCl缓冲液4.5 mL(50 mmol/L，pH 8.2)于试管中，加入2.0 mL蒸馏水后充分混匀，37 ℃水浴30 min，加入2.0 mL不同浓度的女贞子多糖溶液和0.5 mL邻苯三酚溶液(25 mmol/L,37 ℃预热)，混匀后37 ℃水浴6 min，滴加1 mL盐酸(10 mmol/L)终止反应，325 nm下测定吸光值，以上各管均做3组平行。计算对超氧阴离子自由基的清除率，并以L-抗坏血酸做阳性对照[14]。

1.8 数据统计分析

数据采用SPSS18.0统计软件进行分析，用方差分析中的LSD法对多个样本均数进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 葡萄糖标准曲线

依据1.3方法绘制葡萄糖浓度标准曲线，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线方程为y=5.172 9x+0.059 2，R2=0.999 7。

2.2 单因素试验结果

2.2.1酶解时间对女贞子多糖提取率的影响

当酶解时间为30～90 min时，女贞子多糖提取率明显增加，这是由于女贞子多糖浓度未达到饱和时，增加酶解时间有利于女贞子多糖的溶出。酶解时间过短，女贞子多糖溶出不完全，女贞子残渣中的多糖转化率低，易造成女贞子残渣的浪费。随着女贞子多糖提取时间的延长，多糖就有充分的时间从女贞子残渣中扩散到缓冲液中。提取时间90～150 min时女贞子多糖提取率趋于平缓。故选择60、90、120 min 3个水平用于正交实验设计。

2.2.2酶解温度对女贞子多糖提取率的影响

酶解温度在30～40 ℃范围内，随温度的升高，女贞子多糖的提取率逐渐增大，酶解温度在40～50 ℃范围内多糖提取率趋于平缓，这与纤维素酶达到最佳反应温度有关，此时的女贞子被酶解完全。酶解温度在50～70 ℃范围内，女贞子多糖提取率降低，这表明在低于或高于最适温度时酶活力会降低，从而影响多糖的溶出。因此选择30、40、50 ℃ 3个水平用于正交实验设计。

2.2.3酶量对女贞子多糖提取率的影响

酶量在0.2%～0.8%范围内女贞子多糖的提取率增加，当酶量在0.8%～1.0%范围内女贞子多糖提取率趋于平稳。酶量增加会使成本增加，因此选择0.6%、0.8%、1.0% 3个水平用于正交实验设计。

2.2.4pH值对女贞子多糖提取率的影响

pH值在4.4～5.8范围内，女贞子多糖提取率增加，pH值在4.8～5.2范围内，女贞子多糖提取率趋于稳定，当pH值大于5.2时，女贞子多糖提取率下降。pH值为4.8～5.2为纤维素酶最适pH值，在此条件下，女贞子多糖的提取率较高。当pH值超出此范围后，纤维素酶的活反而降低，酶解细胞壁的能力降低，多糖的扩散能力减弱，提取率相应减少。因此选择5.2、5.6、6.0 3个水平用于正交实验设计。

2.3 正交实验结果

从表2中分析得出，四种考察因素对女贞子多糖提取率影响大小顺序为：D>B>C>A，即pH值对女贞子多糖提取率的影响最大，酶解温度、酶量次之，酶解时间影响较小。由实验直观分析和极差分析可以确定主要影响参数为A3B2C3D3，即酶解时间120 min，酶解温度40 ℃、酶使用量1%，酶溶解的pH值为5.2。

用SPSS 18.0统计软件对试验结果进行方差分析，因素D在P<0.05的水平上有显著差异，因素A、B和C不显著。

表 2 L9(34)正交试验设计及结果

2.4 验证实验

准确称取1.0 g女贞子干粉3份，按酶解时间120 min、酶解温度40 ℃、酶量1%和缓冲溶液pH值为5.2这一最佳条件提取3次，苯酚-硫酸法测定吸光度，计算得出女贞子多糖提取率的平均值为6.58%。

2.5 女贞子多糖的抗氧化性研究

2.5.1女贞子多糖对DPPH·自由基清除能力

女贞子多糖能清除DPPH·自由基，当质量浓度达到2.5 g/L时，女贞子多糖和L-抗坏血酸对DPPH·自由基清除率分别为83.66%和94.54%。女贞子多糖和L-抗坏血酸的EC50值分别为0.28 g/L和0.14 g/L，女贞子多糖清除DPPH·自由基能力低于L-抗坏血酸。

2.5.2女贞子多糖对羟自由基清除能力

女贞子多糖能清除羟自由基，清除率随质量浓度的增大而增大。在质量浓度为0～0.5 g/L时，女贞子多糖及L-抗坏血酸对羟自由基清除率都迅速增加，之后趋势变缓；当质量浓度达到2.5 g/L时，女贞子多糖和L-抗坏血酸对羟自由基清除率分别为60.42%和87.45%。女贞子多糖和L-抗坏血酸的EC50值分别为1.07 g/L和0.23 g/L。整体来看，女贞子多糖清除羟自由基能力低于L-抗坏血酸。

2.5.3女贞子多糖对超氧阴离子自由基清除能力

女贞子多糖能清除超氧阴离子自由基，L-抗坏血酸和女贞子多糖在0.1～1 g/L范围内时，自由基清除率增加较快，之后清除率变化趋势平缓；当质量浓度到达2.5 g/L时，女贞子多糖和L-抗坏血酸对超氧阴离子自由基清除率分别为63.48%和84.12%。女贞子多糖和L-抗坏血酸的EC50分别为0.82 g/L和0.45 g/L。整体来看，女贞子多糖清除羟自由基能力低于L-抗坏血酸。

3 讨 论

采用纤维素酶法对女贞子多糖的提取工艺进行研究，考察酶解时间、酶解温度、酶量和pH值对女贞子多糖提取率的影响。在单因素试验基础上进行正交试验优化得到酶法最佳提取工艺为：酶解时间120 min、酶解温度40 ℃、酶量1%和pH值为5.2，优化条件下女贞子多糖提取率高达6.58%。该方法使用可靠，可用于对女贞子多糖的提取。在一定质量浓度范围内，女贞子多糖对DPPH·自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率呈现剂量依赖关系，且清除DPPH·自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的EC50分别为0.28、1.07、0.82 g/L，清除效果均弱于L-抗坏血酸。