牛磺酸中杂质2,2’-亚氨基二(乙烷磺酸)二钠对L929细胞增殖的影响

王 冲，覃婷婷，徐 琳，韩 晶，芮 菁

(天津市药品检验研究院，天津 300070)

牛磺酸化学名称为2-氨基乙磺酸(NH2-CH2-CH2-SO3H)，又称牛胆酸、牛黄素，生物学效应广泛，对于改善记忆能力、保护中枢神经系统及心血管系统、降低血糖、抗肿瘤等方面均有积极作用[1-5]。牛磺酸的结构相对简单，产品由化学合成而来，合成过程中若产生具有较强生物活性的杂质，不仅会降低药物效用，甚至可能产生临床应用的安全性问题。杂质A为牛磺酸中杂质，经本单位抽验检测，不同厂家的产品中均有检出，但其是否具有生物活性尚不明确。本研究采用L929细胞株对杂质A进行体外细胞毒性评价，为制定杂质限度，保障药品质量和安全提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 XS205DU型电子天平(梅特勒公司)；ECLIPSE TS100型倒置显微镜(日本Nikon公司)；HERAcell○R240i型二氧化碳培养箱(Thermo Fisher SCIENTIFIC)；Innova 40型恒温摇床(New Brunswick Scientific公司)；VELOCITY 18R离心机(离心半径12 cm，Dynamica公司)；SpectiaMax M2型酶标仪(Molecular Devices公司)；Attune NxT型流式细胞仪(Life Technologies公司)。

1.2 试药 RPMI Medium 1640培养基(Solarbio公司，批号20170628)；胎牛血清(FBS,杭州四季青生物工程材料有限公司，批号20161225)；0.25% Trypsin-EDTA(Solarbio公司，批号20170316)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT,Coty BioTech○R分装，批号M0793)；二甲基亚砜(DMSO,天津市康科德科技有限公司，批号060515)；FITC AnnexinV/Dead Cell 凋亡试剂盒(Invitrogen公司，批号1809491)；FxCycleTM PI/RNAse Staining Solution 细胞周期试剂盒(Invitrogen公司，批号1825102)。

1.3 细胞株 小鼠成纤维细胞(L-929)，购自中科院上海细胞库，以含10 %胎牛血清(FBS)的1640培养基培养，定期传代。

1.4 受试样品 2,2’-亚氨基二(乙烷磺酸)二钠(杂质A)，白色粉末，易溶于水，天津药物研究院合成，纯度为99%以上，制备方法见图1。试验时，用含10%血清的RPMI 1640培养基将杂质A配制成2.5、5及10 mg/ml 3个不同浓度的溶液使用。

图1 杂质A的制备方法

1.5 方法

1.5.1 对L929细胞的毒性作用 将处于对数生长期的L929细胞消化调整为浓度为1.5×104个/ml的细胞悬液，每孔0.1 ml接种于96孔板，37 ℃、5%(V/V)CO2条件下培养24 h。设置阴性对照组及杂质A低、中、高浓度组，每组8个复孔。弃去原培养液，阴性对照组加入10% FBS-RPMI 1640,杂质A低、中、高浓度组分别加入2.5、5和10 mg/ml的杂质A溶液，每孔0.1 ml，于37 ℃、5%(V/V)CO2条件下继续培养24及48 h。终止培养前4 h，取出细胞培养板于倒置显微镜下观察细胞形态，并按表1标准进行分级。每孔加入20 μl浓度为5 mg/ml的MTT溶液，继续培养4 h后弃去孔内液体，每孔加入150 μl DMSO，放置约10 min后，振荡使孔内溶液颜色均匀，在酶标仪570和630 nm波长下测定吸光度。以各组8个平行孔的平均吸光度值计算相对增殖率(RGR%)[6]。RGR%=杂质A组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值×100%。

1.5.2 对L929细胞凋亡的影响 采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。取处于对数生长期的L929细胞，经消化后调整为浓度为5×105个/ml的细胞悬液，接种于6孔细胞培养板，每孔2 ml。培养24 h后，分别设阴性对照组及杂质A低、中、高浓度组，每组3个复孔。弃去原培养液，阴性对照组加入10% FBS-RPMI 1640，杂质A低、中、高浓度组分别加入2.5、5和10 mg/ml的杂质A溶液，每孔2 ml，置CO2培养箱37 ℃培养。16 h后，收集细胞以PBS洗涤2次，用Annexin-binding缓冲液调整为浓度为1×106个/ml的细胞悬液，取100 μl细胞悬液先后加入Annexin V-FITC及PI抗体避光染色15 min，各管加入400 μl Annexin-binding缓冲液，混匀后以流式细胞仪进行检测[7]。

表1 细胞毒性反应分级标准

1.5.3 对L929细胞周期的影响 采用PI法测定细胞周期，细胞接种、分组及给药方法同“1.5.2”项。16 h后，收集细胞以PBS洗涤2次，离心取上清液，-20 ℃预冷70%乙醇固定过夜。离心去除乙醇，PBS洗涤2次后调整细胞浓度为1×106个/ml，再次离心后各管加入0.5 ml FxCycleTM PI/RNAse Staining Solution避光染色20 min，混匀后以流式细胞仪进行检测[8]。

2 结果

2.1 杂质A对L929细胞的毒性作用 与细胞作用24 h，形态学观察显示：阴性对照组细胞贴壁生长状态良好，细胞呈梭形或不规则三角形，胞质内含大量颗粒状物质，折光性减弱。杂质A与L929细胞作用后，细胞数量降低，由梭形变为圆形，空泡化严重，折光性变强。见图2和表2。MTT法检测显示：杂质A中、高浓度组具有明显的细胞毒性。见图3。与细胞作用48 h，形态学观察显示：阴性对照组细胞数量增加，贴壁生长状态良好。杂质A处理组细胞大量死亡，剩余细胞呈圆形皱缩，贴壁生长状态不佳。见图2和表2。MTT法检测表明：杂质A低、中、高浓度组具有明显的细胞毒性，与阴性对照组相比，具有极显著性差异(P<0.01)，且呈一定的浓度依赖性。见图3。

图2 不同浓度杂质A作用24和48 h后L929细胞形态学改变

表2 杂质A与细胞接触 24和48 h后形态学观察结果

图3 不同浓度杂质A作用

2.2 杂质A对L929细胞凋亡的影响 细胞培养16 h后检测，阴性对照组L929细胞早期凋亡率(Annexin V单阳性细胞占总细胞数的百分率)为5.65%，总凋亡率(Annexin V及PI双阳性细胞占总细胞数的百分比)为9.24%，杂质A 2.5、5和10 mg/ml组早期凋亡率分别为11.26%、21.13%和38.37%，总凋亡率分别为14.33%、25.06%和48.83%，各浓度组均能明显诱导L929细胞凋亡。见图4。

2.3 杂质A对L929细胞周期的影响 与细胞作用16 h后，5 mg/ml杂质A明显延长G0/G1期(P<0.01)，10 mg/ml杂质A显著延长G0/G1期(P<0.01)，明显缩短S期(P<0.05)及G2/M期(P<0.01)，提示杂质A可将细胞周期阻滞于G0/G1期。见表3。

表3 杂质A对L929细胞周期的影响

与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

图4 杂质A对L929细胞的凋亡作用

3 讨论

药品中的杂质可概括为有机杂质、无机杂质和残留试剂3类，通常将药物有机杂质的种类及含量称为杂质谱[9]。针对药品中的每一个杂质，依据其毒性反应制定相应的质量控制限度，是杂质谱控制的理想方法[10]。近年来，中国食品药品检定研究院每年组织全国的药检机构进行药品的国家评价性抽验，使多种药物的杂质谱被阐明，有效促进了产品工艺的改进，推动了上市药品质量的整体提高[11]。

牛磺酸是2017年国家评价性抽验品种之一，理化检测中发现了药品中杂质2,2’-亚氨基二(乙烷磺酸)二钠的存在，其在杂质谱中含量最大，最高时达产品量1%以上。药品中杂质主要来源于两种途径，一是工艺杂质，即从工艺过程中引入的杂质；二是降解产物，即是药物降解产生的杂质。杂质A为主成分生产过程中的副产物，属于工艺杂质[12]。经文献检索，未找到杂质A相关的毒性研究资料[13]。试验研究结果表明，杂质A具有较强的细胞毒性，且能诱导细胞发生凋亡，阻滞细胞周期于G0/G1期，而文献资料表明，药物主成分牛磺酸能够明显保护血管内皮细胞、降低心肌细胞凋亡率[14，15]，可见杂质A与药物主成分药理活性不一致。因此，杂质A的存在有可能会降低药品的质量效果，应引起关注。至于杂质A是否会引发安全性隐患，是否需要实行严格的限度控制，尚需遗传毒性等试验进一步探索研究。