不同环境对快速老化雄性小鼠抑郁与焦虑情绪的影响☆

吴冰洁 董梅 李世平 薛芳 王铭维 詹海燕

随着全世界人口平均寿命增加，受到认知功能减退和痴呆影响的人口比例越来越高，认知功能障碍正在成为影响人类健康和经济发展的问题之一[1-2]。 阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）的精神行为症状包括抑郁、焦虑等，这些会影响AD患者及其照顾者的生活[3]。有研究发现环境和生活方式可影响AD病情进展[4-5]。环境丰富是指相较于标准环境而言，实验动物周围环境条件丰富，使其所处环境更为新颖和复杂，能增加动物的感官、认知、运动和社会参与刺激，进而丰富生活[6]；贫瘠环境是指缺少感官、认知、运动和社会刺激的环境，居住条件单一、闭塞[7]。目前有关环境对AD动物模型抑郁、焦虑情绪影响的研究较少。本研究选择SAMP8小鼠为AD模型，观察不同饲养环境下SAMP8雄性小鼠自主活动和高架十字迷宫实验的表现，旨在探讨不同环境对快速老化雄性小鼠抑郁、焦虑情绪的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 雄性3月龄SAMP8小鼠30只，由香港中文大学解剖系姚大卫教授赠送。入选小鼠经过预选，有明显缺陷（外部肿瘤、运动能力受限）的剔除。实验前平均体质量为（25.24±0.28）g，称量体质量后按随机数字表分为3组：标准环境组、丰富环境组和贫瘠环境组。每组各10只。

1.2 环境设置 参照文献[8-9]设置小鼠生活环境。3组均在室温23～25℃的环境中生活，保持12 h照明、12 h黑暗的周期，自由进食、水，2～3 d清洁并更换1次。标准环境组小鼠饲养于30 cm×18 cm×25 cm（长×宽×高）的透明玻璃笼内，每笼5只，笼内只有垫料（图1A）。丰富环境组小鼠饲养于45 cm×28 cm×25 cm（长×宽×高）的透明玻璃笼内，每笼5只，笼内设有金属制小桥、斜架，直径3 cm PVC隧道，塑料跑笼，金属链条，各种形状及颜色的塑料玩具（球、盒、铃铛等），各种形状及颜色的木制积木（图1B）。贫瘠环境组小鼠饲养于18 cm×6 cm×15 cm（长×宽×高）的透明玻璃笼，每笼1只孤养，每个笼子之间用纸板隔开间距约4 cm（图1C），小鼠之间绝对不能碰面。

图1 小鼠饲养环境。 A标准环境；B丰富环境；C贫瘠环境

1.3 观察指标

1.3.1 体质量 每周于固定时间测量各组小鼠体质量及观察记录生活状态。

1.3.2 自主活动（autonomic activities）小鼠饲养8周后测量该指标。通过观察小鼠进入熟悉并封闭的环境后各种自发活动，判断其神经精神变化，如抑郁症状等。ZH-YLS-2A小鼠自主活动仪（安徽淮北正华生物仪器有限公司生产）由4个直径25 cm、高14 cm的圆形黑色活动箱组成（图2A）。工作状态下自主活动仪发射激光束，小鼠在活动时遮挡激光束，此信号传到计算机中而被记录为活动次数。小鼠在活动箱中适应3 min后，计算机记录6 min内的活动次数。

1.3.3 高架十字迷宫实验（elevated-plus maze test）小鼠饲养8周后测量该指标。高架十字迷宫是焦虑相关研究中应用最广泛的实验之一[10]。小鼠在开放区停留时间反映其焦虑程度。ZH-DSG高架十字迷宫 （安徽淮北正华生物仪器有限公司生产）包括两条相对的开放臂（42 cm×15 cm）和两条闭合臂 （42 cm×15 cm×20 cm）， 由中央区（15 cm×15 cm）联结，闭合臂顶部为透明树脂材料，周围为灰色不透明树脂材料，迷宫底板距地面60 cm（图2B）。将小鼠面向开放臂放置在中央区，同时开始记录5 min内小鼠在开放臂停留的时间（以双前肢进入为准）。测试时室内为暗光，室温保持在（21±2）℃，距离1.5 m观察记录小鼠的活动。

图2 行为学测试仪。 A自主活动仪；B高架十字迷宫

1.4统计学方法 用SPSS 22.0进行统计分析。3组8周末体质量、自主活动次数、高架十字迷宫实验开放臂停留时间的数据服从正态分布，但不具方差齐性，数据以均数±标准差（x±s）描述，组间比较采用方差分析（Welch法），丰富环境组和贫瘠环境组分别与标准环境组进行两两比较，采用Dunnett's T3检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 生活状态和体质量变化 8周末，丰富环境组小鼠毛发整齐，皮肤完整，能主动玩耍。丰富环境组与标准环境组相比，有群体间互动现象，每次更换玩具时，对新异刺激物比较有兴趣。贫瘠环境组在4～5周时，3只小鼠有程度不等的臀部皮肤咬伤，6周时有2只小鼠死亡。

在8周饲养过程中，丰富环境组小鼠体质量呈先增长后下降趋势；贫瘠环境组小鼠体质量变化不大，呈曲折中逐渐下降趋势；标准环境组体质量呈先下降后增长趋势（图3）。8周末3组间体质量差异无统计学意义（F=3.530，P=0.053）。

图3 不同环境组行为测试前体质量变化折线图。SE为标准环境组；IE为贫瘠环境组；EE为丰富环境组

2.2 自主活动 饲养8周后，3组小鼠6 min内的活动次数差异有统计学意义 （F=57.263，P＜0.001）。两两比较，丰富环境组与标准环境组间无统计学差异（P=0.126），贫瘠环境组与标准环境组活动次数差异有统计学意义（P＜0.001）。见表1。

2.3 高架十字迷宫实验 饲养8周后，3组小鼠高架十字迷宫开放臂停留的时间差异有统计学意义（F=25.224，P＜0.001）。 两两比较，丰富环境组与标准环境组间无统计学差异（P=0.354），贫瘠环境组与标准环境组开放臂停留时间差异有统计学意义（P＜0.001）。见表 1。

表1 不同环境组小鼠行为学测试结果

3 讨论

本研究以SAMP8雄性小鼠为AD模型，在不同环境下饲养8周，结果发现在丰富环境中生活的SAMP8鼠群生活更为和谐，活动和互动较多；在贫瘠环境中生活的小鼠存在自残、自杀倾向。3组小鼠8周末的体质量尚不能认为存在差异。行为学测试方面，与标准环境组比较，尚不能认为丰富环境对抑郁、焦虑情绪产生积极影响；但贫瘠环境可加重SAMP8小鼠的精神行为（抑郁、焦虑）异常。

快速老化小鼠（senescence-accelerated mouse,SAM）是一类显示早衰的近交系小鼠系列,此系列由多个子系列组成，每个系列表现为不同的功能障碍。SAMP8为其中的一个子系列，有早期老化和加速老化的特点，表现为年龄相关的学习记忆障碍、异常情绪改变、昼夜节律紊乱[11-12]，这些特征的产生可能与氧化应激、炎症、神经元死亡通路激活、胆碱能缺陷、淀粉样蛋白积累、老年斑形成等有关[13]。SAMP8小鼠在3月龄出现记忆力减退，4月龄能表现出焦虑、抑郁行为，而且随月龄增加而症状加剧[14-15]。本研究在进行行为学测试时SAMP8小鼠已经到达5月龄，因此已具有焦虑、抑郁等异常精神行为。HÜTTENRAUCH等[10]研究以5XFAD小鼠为AD模型，发现环境丰富不能改善焦虑相关的行为缺陷。APP/PS1KI小鼠经过4个月的丰富环境暴露后，焦虑水平没有发生明显变化[16]。但是PIETROPAOLO等[17]和GORTZ等[18]的研究结果显示环境丰富组AD小鼠焦虑相关行为减少。因此丰富环境对焦虑的作用仍存在争议。至于对抑郁方面的研究，鲜少有实验研究AD小鼠的生活环境对抑郁的影响。在贫瘠环境中生活的SAMP8小鼠，它们所接受的刺激减少，并且处于一种社会孤立状态。既往研究表明，贫瘠环境可加重认知功能异常[19]和脑缺血损伤程度[20]，不利于情感认知体系形成[21]，对身体健康和情绪稳定状态造成负面影响。MEIJERS等[22]以监狱中男囚犯为研究对象，发现监禁3个月后，其自我控制力降低、注意力降低。在本研究中贫瘠环境组的小鼠有皮肤咬伤及死亡现象出现，说明贫瘠环境可能促使SAMP8小鼠出现自残、自杀倾向，提示这是一种情感调控失衡的表现。通过自主活动和高架十字迷宫实验，更加印证了贫瘠环境可加剧SAMP8小鼠抑郁、焦虑情感异常程度的假设。

本研究存在一定不足。第一，本研究的目的在于探究不同环境对SAMP8雄性小鼠精神行为的影响，但是未对其分子机制、基因表达进行进一步探究。有研究表明丰富环境刺激可减轻氧化应激（oxidative stress,OS）水平[23]，焦虑和 OS 之间存在很强的相关性，OS启动后细胞因子增加，细胞因子高水平表达使小鼠表现为更高的焦虑状态[3]。向大鼠注射原纤维蛋白Aβ1-42后，这种淀粉样聚集物刺激脑内活性氧生成、脂质过氧化和海马、皮层、纹状体区抗氧化酶活性抑制，诱导氧化应激，大鼠表现为焦虑和认知功能损害[24]。有氧运动通过降低脑组织中脂质过氧化作用及提高抗氧化含量来降低氧化应激，保护动物免受应激影响，减少焦虑行为[25]。AD的抑郁障碍可能与炎症通路激活有关。有研究发现向动物注射淀粉样β肽低聚物（oligomers of the amyloid-β peptide,AβO）， 其脑组织中白介素 1β（interleukin-1β,IL-1β）和肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平明显升高，在症状上表现为抑郁样行为[26]。炎症介质增加会对情绪功能产生不利影响，丰富环境有助于下调IL-1β和TNF-α的表达[27]。丰富的环境刺激不仅能加强学习和记忆能力，还可以提高应对恐惧、焦虑的能力。贫瘠环境减少了感官、运动和认知刺激、社会活动以及身体活动，使动物处于活动缺乏的状态[28]。未来研究可着重关注环境对SAMP8小鼠精神行为的作用机制，研究机制主线路主要包括以下方面：①神经形成和再生；②神经凋亡和坏死的相关通路因子；③氧化应激；④神经内分泌相关系统。第二，丰富环境组和标准环境组的自由活动次数和开放臂停留时间在均数上存在较大差异，但是该差异未有统计学上的意义，提示需要进一步扩大样本量来进行研究。

本实验的更高目的在于为临床应用提供证据。在实际生活中，AD患者往往在类似贫瘠的环境中生存，少刺激、少活动、少社交，患者焦虑、抑郁、日常生活能力下降，但可以通过定期给予认知和多感官刺激来增强其大脑可塑性[29]。生活环境丰富，多种形式的身体活动、感官刺激、社会交际会对AD产生众多积极影响[30-33]。综上，本研究结果提示，丰富环境使SAMP8雄性小鼠生活活跃、鼠间交流增多，但尚不能认为对焦虑、抑郁产生影响；贫瘠环境使SAMP8雄性小鼠活动力下降，产生自杀、自残倾向，加重焦虑、抑郁症状。