HPLC法测定肾乐胶囊中阿魏酸含量

王欢欢，黄晓舞（解放军总医院制剂中心，北京 100853）

肾乐胶囊是解放军总医院非标准制剂品种，由水蛭、当归、党参等五味中药组成，具有活血化瘀，益气养血，健脾利湿的功效。用于慢性肾小球肾炎或伴肾功能不全早、中期，证属气虚血瘀兼水湿者，症见神疲乏力，腰酸腰痛，面色无华或晦暗，面浮肢肿，纳呆，舌质淡暗或有瘀点瘀斑，苔薄白或腻，脉沉细或细弱。该药在临床应用多年，质量可靠，疗效显著。肾乐胶囊现行标准制定时间较早，要求比较低，为了更好的控制其内在质量，有必要对原有标准进行提高。本研究采用HPLC法对肾乐胶囊中阿魏酸含量进行测定，旨在更好的控制肾乐胶囊的质量。

1 仪器与材料

XS105型电子天平（梅特勒精密仪器有限公司）；Agilent 1260液相色谱仪（美国Agilent公司）； KQ-100DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；列孔型电热恒温水浴锅（天津市中环科技开发公司）。

肾乐胶囊（解放军总医院自制，批号：SL170501、SL170502、SL170503）；阿魏酸对照品（含量按99.0%计，中国食品药品检定研究院，批号：110773-201614）。甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为高纯水。

2 方法

2.1 色谱条件[1-3]

色谱柱：Agilent EclipseXDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-1%醋酸水溶液（3 : 7）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：313 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。理论塔板数按阿魏酸峰计应不低于1500。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸对照品13.10 mg（批号：110773-201614，含量按99.0%计），置100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀；精密量取5 mL，置50 mL的棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含12.97 μg的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取装量差异项下的内容物，研细，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理40 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 取不含党参、陈皮和当归药材的阴性样品，按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。

2.3 专属性实验

取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。结果显示，供试品中阿魏酸与对照品在相同保留时间处有相同色谱峰，峰形良好，与其他组分峰基线分离度较好，且阴性样品无干扰。

2.4 线性关系考察

精密量取贮备液适量，分别加甲醇稀释配成不同浓度对照品溶液。分别精密量取贮备液和不同浓度对照品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得阿魏酸线性回归方程：y=899395.323x+ 40187.336（r= 0.9999）。结果表明：阿魏酸的浓度在2.5938 μg·mL-1～ 64.8450 μg·mL-1范围内峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度实验

取阿魏酸对照品溶液（浓度为12.97 μg·mL-1）适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果显示，阿魏酸峰面积RSD为0.62%（n= 6），表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验

精密称取批号SL170501供试品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果表明阿魏酸含量平均值为0.0480 mg·粒-1，RSD为1.58%（n= 6），表明本方法重复性良好。

2.7 中间精密度实验

取本品（批号：SL170501）细粉适量，在不同时间，由不同的实验人员，使用不同的仪器（Agilent 1200液相色谱仪），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果表明，含量测定中间精密度实验阿魏酸平均含量为0.0480 mg·粒-1，RSD为1.15%（n=12），表明该方法测定本品含量中间精密度良好。

图1 高效液相色谱图A – 阿魏酸对照品；B – 供试品；C – 阴性样品；1 – 阿魏酸Fig 1 HPLC chromatograms A – ferulic acid control; B – test sample; C – negative reference substance; 1 – ferulic acid

2.8 回收率实验

精密称取本品（批号：SL170501，含量：0.0480 mg·粒-1）细粉约0.5 g，置具塞锥形瓶中，加入浓度为10.4049 μg·mL-1的阿魏酸对照品溶液（阿魏酸对照品批号：110773-201614，含量按99.0%计）5 mL，再精密加入甲醇20 mL，称定重量，超声处理40 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，平行制备6份供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率。结果见表1。

2.9 稳定性实验

取“2.2.2”项下供试品溶液，室温放置，分别于0、4.0、7.5、11.0、15.5、20.5、26.0、35.0 h按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，供试品中阿魏酸峰面积RSD为1.24%（n= 8），表明供试品溶液室温放置35 h内稳定。

表1 回收率测定结果. n = 6Tab 1 Results of recovery test. n = 6

2.10 含量测定

取三批中试样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果. n = 3Tab 2 Results of contents determination of samples. n = 3

3 讨论

3.1 专属性考察

在含量测定专属性实验中，取缺当归的阴性样品，结果阴性样品溶液的色谱图中在与对照品溶液色谱图中相应的位置有相同的色谱峰出现，表明阴性样品干扰本品阿魏酸的测定。通过查阅相关文献[1,4]，处方中党参、陈皮药材中也含有阿魏酸，为进一步确定干扰来源，分别取当归、党参、陈皮和茯苓药材细粉各约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，照供试品处理方法依法制备供试品溶液，与对照品溶液，按上述色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，茯苓中不含阿魏酸，当归、党参和陈皮中均含有阿魏酸，故将标准修订为测定党参、陈皮和当归中总阿魏酸含量。

3.2 提取方法和时间考察

在含量测定过程中发现，供试品采用乙酸乙酯超声提取时，样品结块，分散不均匀，影响本品含量的准确测定，故在原标准的基础上，对供试品的处理方法进行筛选，优化，使本品含量能准确测定。比较了不同提取溶剂[5-8]（水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和95%乙醇）对样品含量的影响，结果除采用乙醇提取，供试品溶液色谱图中主峰前延，影响含量准确测定，其它溶剂供试品色谱图中，主峰峰形良好，且与相邻杂质峰分离度符合要求，不干扰本品含量测定，且甲醇提取时，样品在提取过程中不结块，分散均匀，能将供试品中阿魏酸提取完全，故确定本品的提取溶剂为甲醇。同时考察了不同提取时间（10、20、30、40、50、60 min）对含量的影响，试验结果表明，超声40 min时，本品中阿魏酸能提取完全，故确定本品提取时间为40 min。

3.3 系统耐用性考察

为了考察微小变动因素对本品含量测定的影响，调节流速（0.9、1.0、1.1 mL·min-1）、柱温（25、30、35 ℃）和流动相比例（30 : 70、33 : 67、27 : 73）进行试验，含量分别为：0.0477 mg·粒-1、0.0483 mg·粒-1、0.0475 mg·粒-1、0.0491 mg·粒-1、0.0477 mg·粒-1、0.0482 mg·粒-1、0.0470 mg·粒-1（RSD为1.41%，n= 7），结果表明在测试条件有微小变动时，测定结果基本不受影响，此测试条件的耐用性良好。

3.4 含量限度考察

根据以上含量测定数据，结合大生产工艺因素和不同批次间药材含量的高低变化，以及成品片重差异范围等影响含量变化因素，为确保成品质量，暂定本品每粒含党参、陈皮和当归以阿魏酸（C10H10O4）计,不得少于0.0450 mg。