铁皮石斛原球茎诱导率提升的研究

黄靖 刘春英 袁亚芳

关键词：铁皮石斛;原球茎;诱导;培养基

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.11.002

铁皮石斛Dendrobium officinale Kimuraet Migo又称黑节草，属兰科石斛属，为兰科多年生附生草本植物，是一种珍贵的野生药用植物。石斛属DendrobiumSw是兰科Orchidaceae中的第二大属，迄今全球已发现有1500多种植物，我国有70多个种。现代药理研究表明，铁皮石斛具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用，因此在临床上及中药复方中被广泛应用[1]。铁皮石斛蒴果成熟时易开裂，且种子粒径小，自然繁殖率低。由于铁皮石斛生长条件的特殊性和分布的局限性以及多年的人为过度采挖破坏，自然资源濒临枯竭，成为濒危植物，被列为国家重点保护的野生药材品种。近年来，在铁皮石斛产业发展的推动下，大多数从事铁皮石斛组织培养的企业，主要是采用种子播种方式。由于使用的果荚没有严格把关，生产出来的种苗分化、混杂现象严重，种植出来的铁皮石斛品质无法得到保证，严重影响了铁皮石斛产业的发展。因此，为了保护和有效利用铁皮石斛，采用组织培养技术，大量快速繁殖铁皮石斛组培苗显得尤为重要。

组培工厂化生产育苗要求配方稳定、繁殖系数高、成本低和种苗质量稳定[2]。目前有关铁皮石斛快速繁殖研究报道中，多集中以种子、茎尖、茎段等为外植体，并通过原球茎的增殖与分化来繁殖种苗[3]。

通过茎段原球茎的途径，生产出的种苗都来源于同一母本，性状整齐一致，可以解决种子播种的种苗混杂问题，且繁殖系数高;但是，原球茎诱导的控制难度较大，生产上没有得到广泛应用[4]。以铁皮石斛种子诱导原球茎，再通过原球茎的分化、增殖培养而得到大量幼苗，这种快繁方法可加快铁皮石斛繁殖速度，推进工厂化育苗[5]。本研究以福清佳家农业综合开发有限公司的铁皮石斛种子、茎段为原材料，采用单因素试验法对原球茎的诱导和增殖的培养基配方进行筛选，以期建立一整套铁皮石斛茎段原球茎途径的组培生产技术流程，应用于工厂化生产。

1材料与方法

1.1试验材料

试验材料采自福清佳家农业综合开发有限公司，种植于基地温室大棚。

1.1.1茎段的处理选择健康、无病虫害为害的当年生铁皮石斛嫩茎，去除叶片，带回实验室。

1.1.2成熟蒴果的處理采集铁皮石斛成熟蒴果，经过表面消毒处理，剖开蒴果取出种子接种到原球茎诱导培养基上。

1.2试验方法

1.2.1茎段消毒茎段先用自来水冲洗干净，再用流水冲洗5 min，然后用无菌滤纸吸干表面水分。在超净工作台上，将茎段剪成3 cm长的小段，每段带1～2个茎节。先用75%酒精浸泡30 s，再放入0.1 L汞溶液中浸泡6 min;之后用无菌水冲洗3次，再用无菌滤纸吸干，在无菌碟子上切去两端伤口，并切成带一个节的小段，接种到不同的诱导培养基上。

1.2.2蒴果的消毒将铁皮石斛的蒴果先用自来水冲洗干净，再置于洗洁精溶液中摇洗10 min，取出蒴果用自来水洗净，沥干水后，在超净工作台上先用75%的酒精消毒2 min;倒去酒精，再用0.1%升汞消毒15 min;倒去升汞消毒液，用无菌水冲洗4～5次，沥干备用。接种时，将经过表面消毒的蒴果放在无菌的不锈钢盘上，切除头尾约0.5 cm，然后将蒴果中段沿纵轴切开，取出种子，均匀地接种到培养基表面。

1.2.3原球茎的诱导茎段及种子均以MS和1/2MS为基本培养基，设置8个处理，分别添加不同浓度的NAA（表1）。将材料接种在原球茎诱导培养基中，每个处理接种5个培养皿，每个培养皿接种10个外植体，30 d后统计原球茎的诱导情况。

2结果与分析

2.1不同外植体及激素对原球茎诱导的影响

接种10 d起，外植体均开始萌发，30 d左右可明显看到膨大的原球茎，且部分原球茎开始分化出芽尖。60 d左右可明显看到分化出的小苗。

由表3可以看出，不同处理种子均可萌发诱导出原球茎，而以种子为外植体的原球茎诱导率远高于以茎段为外植体的诱导率，其中以MS为基本培养基处理原球茎诱导率均高于以1/2MS为基本培养基处理。MS添加NAA 0.1 mg·L-1处理的原球茎诱导率高达98.7%，处理4的诱导率最低，为41.6%。由此可以看出，NAA浓度过高抑制幼苗分化，而低浓度NAA有利于促进幼苗分化。

综合原球茎诱导和分化情况可知，MS中添加0.1 mg·L-1 NAA可有效促进铁皮石斛种子萌发和发育。

2.2不同激素浓度对原球茎增殖的影响

从表4可以看出，铁皮石斛的原球茎体具有较强的增殖能力。即使只在基本培养基中，经60 d培养后，其增殖系数仍可高达21.4。在添加NAA 0.1 mg·L-1的条件下，6BA的最佳用量为0.5 mg·L-1，即处理③，铁皮石斛原球茎体的增殖系数高达45.8。该处理中每瓶接入5个原球茎体，经60 d培养后，最多的1瓶增殖出的原球茎体数多达297个，统计5瓶，共增殖出2290个原球茎体。继续增加6BA用量后，原球茎增殖系数反而下降，当6BA用量达到2.0 mg·L-1时，增殖系数开始下降至34.9。

3结果与讨论

原球茎诱导是铁皮石斛原球茎途径组织培养的一个关键环节，诱导率的高低直接影响组培工厂化生产的成本。常规组培手段采用的原球茎诱导多使用铁皮石斛茎段及茎尖为外植体，诱导率普遍低于50%，本研究通过接种成熟种子对原球茎诱导培养基筛选发现，在MS+NAA 0.1 mg·L-1+琼脂7.0 g·L-1+蔗糖30.0g·L-1上，铁皮石斛成熟种子萌发诱导产生原球茎比率高达98.7%。在MS+NAA 0.1 mg·L-1+6BA 0.5 mg·L-1+琼脂7.0 g·L-1+蔗糖30.0 g·L-1上，原球茎能大量进行增殖。试验结果也表明添加一定浓度的生长素和细胞分裂素能有效促进铁皮石斛原球茎的诱导，但浓度过高或过低均不利于原球茎的诱导及增殖。

组织培养获得铁皮石斛再生植株的途径有多种，关于利用成熟种子进行快繁，文献报道较多的是用成熟的种子消毒后进行无菌播种形成原球茎，并经过增殖、分化发育成完整植株[5]。本研究主要是采用将种子消毒后无菌播种诱导产生原球茎，增殖原球茎，再通过转换培养基促进小苗增殖的方法，进而达到快繁的目的。

参考文献：

[1]莫昭展，贝学军，杨小飞，等.铁皮石斛丛生芽增殖研究[J].西北林学院学报，2008，23（6）：104-107.

[2]林江波，王伟英，李海明，等.铁皮石斛茎段原球茎的诱导、分化与植株再生[J].福建农业学报，2016，31（10）：1075-1079.

[3]张寿文，苏慧慧，铁皮石斛原球茎分化的研究概述[J].中国现代中药，2014，16（4）：274-276.

[4]林茜，林贵美，韩晓华，等.利用铁皮石斛原球茎进行组培快繁[J].南方农业学报，2015，46（9 ）：1557-1560.

[5]石丽敏，卢华兵，胡贤女.铁皮石斛原球茎诱导分化与增殖试验[J].浙江农业科学，2015，56 （8 ）：1191-1192.

（责任编辑：柯文辉）