基于psbA-trnH和rDNA ITS序列的不同地理居群巴戟天聚类分析

许子欣 冉志芳 杨小彤 郝庆秀 余意 周洁 郭兰萍

摘要：【目的】基于psbA-trnH和rDNA ITS序列進行不同地理居群巴戟天聚类分析，探讨不同地理居群巴戟天遗传变异与地理分布之间的相关性，为其道地性研究提供理论参考。【方法】以13个来自广东、广西和福建的不同地理居群巴戟天为研究对象，采用改良CTAB法提取其新鲜叶片DNA，以其为模板分别扩增psbA-trnH和rDNA ITS序列。采用ClustalX 1.81进行多重对位排列，应用MEGA 6.06中K2P（Kimura 2-parameter）模型计算遗传距离，并运用邻近法构建系统发育进化树。【结果】不同地理居群巴戟天的psbA-trnH序列长度为306 bp，GC含量为27.2%，保守率83.33%，变异率16.67%，简约信息率26.14%;不同地理居群巴戟天的rDNA ITS序列长度为571 bp，GC含量为64.1%，保守率91.42%，变异率8.58%，简约信息率14.19%。不同地理居群巴戟天的psbA-trnH序列遗传距离为0～0.128，其中广东省的5个样品间遗传距离整体较小;福建省的4个样品与广西和广东的样品间遗传距离整体较大。不同地理居群巴戟天的rDNA ITS序列遗传距离为0～0.102，其中福建省的永定2号与其他样品遗传距离均较大。基于psbA-trnH和rDNA ITS序列构建的系统发育进化树均将广东省的5个巴戟天样品聚为一支，但rDNA ITS序列构建的系统发育进化树还将广西区的4个巴戟天样品聚为一支，说明其可较好地区分广东省和广西区不同地理居群的巴戟天。【结论】巴戟天遗传结构与地理分布存在一定的相关性，深入研究巴戟天遗传变异与地理分布间的相关性时应以rDNA ITS序列为主、psbA-trnH序列为辅。

关键词： 巴戟天;居群;psbA-trnH;rDNA ITS;系统发育进化树;聚类分析

中图分类号： S567.239                          文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2018）12-2364-07

Cluster analysis of Morinda officinalis How in different geographical populations based on psbA-trnH and rDNA ITS sequences

XU Zi-xin1， RAN Zhi-fang2， YANG Xiao-tong2， HAO Qing-xiu3，

YU Yi4*， ZHOU Jie1*， GUO Lan-ping3

（1 School of Biological Science and Technology，University of Jinan，Jinan  250022， China; 2 School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan  250022， China; 3 The State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijng  100700， China; 4 Infinitus（China） Company Ltd.，

Guangzhou  510627， China）

Abstract：【Objective】Cluster analysis of Morinda officinalis How located in different geographical populations were analyzed based on PsbA-trnH and rDNA ITS sequences， and the relationship between genetic variation and geographical distribution was explored， which provided basic data for the researches of geoherb. 【Method】A modified CTAB method was used to extract fresh leaf DNA from 13 different geographical populations of M. officinalis from Guangdong， Guangxi and Fujian. Specific primers were designed to amplify psbA-trnH and rDNA ITS sequences. The software of Clustal X 1.81 was used for multiple sequence alignment， and the pairwise distance was calculated based on K2P（Kimura 2-parameter） model by MEGA 6.06 software， and the phylogenic tree was constructed by Neighbor-joining method. 【Result】The psbA-trnH sequences of M. officinalis from different geographical populations were 306 bp， the GC content was 27.2%， the conserved rate was 83.33%， the mutation rate was 16.67%， and the simple information rate was 26.14%. The rDNA ITS sequences of M. officinalis from different geographical populations were 571 bp， the GC content was 64.1%， the conserved rate was 91.42%， the mutation rate was 8.58%， and the simple information rate was 14.19%. The genetic distances of psbA-trnH sequences of M. officinalis from different geographical populations ranged from 0 to 0.128， among which the genetic distances among the five samples in Guangdong were small as a whole. And the genetic distances between four samples from Fujian and those from Guangxi and Guangdong were large. The genetic distances of rDNA ITS sequences of M. officinalis from different geographical populations ranged from 0 to 0.102. The genetic distances between Yongding 2 in Fujian and other samples were large. The phylogenetic tree based on psbA-trnH and rDNA ITS sequences could cluster five M. officinalis samples from Guangdong into one branch， but the phylogenetic tree based on rDNA ITS sequence could cluster four M. officinalis samples from Guangxi into one branch， which showed that the phylogenetic tree could better distinguish M. officinalis from different geographical populations in Guangdong and Guangxi. 【Conclusion】There is certain correlation between genetic structure and geographical distribution of M. officinalis. The intensive study of the correlation between genetic variation and geographical distribution of M. officinalis should be based on ITS sequence and supplemented by psbA-trnH sequence.

Key words： Morinda officinalis How; populations; psbA-trnH; rDNA ITS; phylogenetic tree; cluster analysis

0 引言

【研究意义】巴戟天（Morinda officinalis How）为茜草科巴戟天属植物，始载于《神农本草经》，主产于广东、广西、福建、海南等地，其干燥根是我国“四大南药”之一，性甘、辛，微温，具有补肝肾、强筋骨、祛风湿等功效（国家药典委员会，2015）。近年来，巴戟天需求急剧增加，不同产地的巴戟天不断涌入市场，导致药材品质良莠不齐，给临床用药带来巨大挑战（刘瑾，2009;丁平等，2012;卢洪梅等，2018）。道地药材是公认的优质药材，其表型是基因型与环境饰变的结果，其中基因型是决定道地药材品质的重要因素（黄璐琦和张瑞贤，1997;黄璐琦等，2008）。因此，探究不同地理居群巴戟天的遗传变异对其药材道地性研究具有重要意义。【前人研究进展】随着分子生药学的发展，药用植物的群体遗传结构研究迅速开展，基因序列是常用分子标志（张君毅，2007;柏国清等，2017;林爽等，2017;王明强等，2017）。psbA-trnH序列为psbA基因和trnH基因间的一段非编码序列，是叶绿体基因组中进化速率最快的基因间隔区之一（姬生国等，2011;彭小凤等，2015），但psbA-trnH基因在序列和结构上相对保守，广泛应用于较近分类群及地理种群的研究。已有较多学者将psbA-trnH序列用于山东丹参（Salvia shandongensis）（李晓娟等，2013）、茜草（Rubia cordifolia Linn.）（夏至等，2016）等药用植物及其近缘种的快速鉴别。rDNA ITS序列具有较多的拷贝数，可提供较丰富的变异位点和信息位点，是研究生物类群系统与进化的重要分子标记（李亚，2013;李亚等，2013）。已有较多学者将rDNA ITS序列用于山药（Dioscoreae rhizoma）（吴志刚等，2014）、玫瑰花（Rosae rugosae Flos）（李洪芹等，2015）等药用植物不同种质的鉴别，但应用于巴戟天遗传分析的研究报道较少，仅丁平等（2012）采用rDNA ITS序列分析研究不同地理居群巴戟天的基因分化。【本研究切入點】至今，鲜见将psbA-trnH序列与rDNA ITS序列相结合对不同地理居群巴戟天进行聚类分析的文献报道。【拟解决的关键问题】以13个不同地理居群的巴戟天为材料，对其rDNA ITS序列和psbA-trnH序列进行扩增，并基于遗传变异情况进行聚类分析，为巴戟天药材的道地性研究提供理论参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

于2017年8月从广东、广西和福建3个省（区）野外采集巴戟天新鲜叶片，迅速放入硅胶中干燥保存，存放于济南大学生物科学与技术学院植物标本馆，并由中国中医科学院中药资源中心郭兰萍研究员鉴定，详见表1。样品名称由笔者根据采集地命名。主要试剂：Taq-HS PCR Forest Mix（2×）购自江苏愚公生命科技有限公司;柱式植物提取试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司。主要仪器设备：NanoDrop2000超微量分光光度计（Thermo，美国）、台式多用离心机（Thermo，美国）、T100PCR仪（Bio-Rad，美国）、Mini-PROTEAN? Tetra电泳槽（Bio-Rad，美国）、HH-6数显恒温水浴锅（上海析达仪器有限公司）和ChampGel? 5000全自动凝胶成像分析系统（上海天能科技有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 DNA提取 参照柱式植物DNAOUT提取试剂盒提取不同地理居群巴戟天新鲜叶片基因组DNA，并以1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量（110 V 30 min），电泳结束后用溴化乙锭染色，在全自动凝胶成像分析系统下观察拍照;采用超微量分光光度计测定其浓度;采用分光光度法测定其在260和280 nm下的吸光值（A），计算二者比值（A260/A280）（Shahzadi et al.，2010）。

1. 2. 2 引物设计及合成 参考姬生国等（2011）、丁平等（2012）设计的特异性引物（表2）进行PCR扩增。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2. 3 PCR扩增和测序 psbA-trnH和rDNA ITS序列的PCR反应体系50.0 ?L：Taq-HS PCR Forest Mix 15.0 ?L、10 ?mol/L上、下游引物各2.0 ?L、DNA模板5.0 ?L，ddH2O补足至50.0 ?L。rDNA ITS序列的扩增程序：94 ℃预变性2 min;94 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行40个循环;72 ℃延伸8 min。psbA-trnH序列的扩增程序：94 ℃预变性4 min;94 ℃ 50 s，55 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，进行30个循环;72 ℃延伸7 min。PCR扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测（110 V，30 min），电泳结束后用溴化乙锭染色，在全自动凝胶成像分析系统下观察拍照，切取目标条带进行纯化，并送至铂尚生物技术（上海）有限公司测序。

1. 3 序列分析

采用CodonCode Aligner V6.0.6对测序结果进行校对拼接，并删除序列两端低质量序列;利用ClustalX 1.81的Alignment进行多重对位排列（Multiple alignments）;应用MEGA 6.06中K2P（Kimura 2-parameter）模型计算遗传距离并构建遗传距离矩阵;采用邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树，并以Bootstrap（自展法）进行1000次可信度检测（张兵锋等，2017）。

2 结果与分析

2. 1 DNA提取结果

采用超微量分光光度计测定DNA浓度，并稀释至20 ng/?L，其A260/A280为1.75～1.83，表明DNA纯度较好，可用于后续试验。

2. 2 PCR扩增结果

由图1和图2可知，psbA-trnH和rDNA ITS序列的PCR产物分别约400和600 bp，与预期结果相符，且条带清晰，亮度大，表明PCR扩增效率高，经纯化后可直接用于测序。

2. 3 psbA-trnH和rDNA ITS序列分析结果

基于GenBank数据库中同科属物种psbA-trnH序列的注释，去除其两端的psbA和trnH基因。采用MEGA 6.06进行psbA-trnH序列分析，并将排序后的序列组成数据矩阵，结果如表3所示。不同地理居群巴戟天的psbA-trnH序列长度为306 bp，GC含量为27.2%;保守位点有255 bp，占序列总长度的83.33%（保守率）;变异位点为51 bp，占序列总长度的16.67%（变异率）;简约信息位点为80 bp，占序列总长度的26.14%（简约信息率）。

将rDNA ITS序列的PCR扩增产物与GenBank中发布的巴戟天rDNA ITS序列进行比对，结果发现核苷酸序列相似度为96.7%，该序列包含ITS序列全长及18S和26S部分序列，表明PCR扩增条带为rDNA ITS序列。采用MEGA 6.06进行rDNA ITS序列分析，并将排序后的序列组成数据矩阵，结果如表3所示。不同地理居群巴戟天的rDNA ITS序列长度为571 bp，GC含量为64.1%，保守位点为522 bp，占序列总长度的91.42%（保守率）;变异位点为49 bp，占序列总长度的8.58%（变异率），其中碱基的缺失和替换是主要的变异类型;包含简约信息位点为81 bp，占序列总长度的14.19%（简约信息率）。rDNA ITS序列中的5.8S具有极大的保守性，不存在变异位点。

2. 4 遗传距离分析结果

采用MEGA 6.06中的K2P模型计算不同巴戟天样品psbA-trnH序列和ITS序列的遗传距离并构建遗传距离矩阵，结果如表4和表5所示。不同地理居群巴戟天的psbA-trnH序列遗传距离为0～0.128，其中广东省的5个样品间遗传距离整体较小;福建省的4个样品与广西和广东的样品间遗传距离整体较大。不同地理居群巴戟天的rDNA ITS序列遺传距离为0～0.102，其中福建的永定2号与其他样品遗传距离均较大，表明巴戟天不同居群间的遗传距离与地理距离在一定程度上呈正相关。

2. 5 系统发育树分析结果

采用邻接法对不同居群巴戟天样品进行聚类分析并构建系统发育进化树。其中，基于psbA-trnH序列构建的系统发育树如图3所示，3个不同省（区）的巴戟天样品可聚成八个分支，其中广东省的5个巴戟天样品聚为一支，自展支持率为71%;广西区的岑溪1号和岑溪2号聚成一支，自展支持率为80%;广西区的苍梧1号和苍梧2号及福建的4个巴戟天样品均单独为一支。

基于rDNA ITS序列构建的系统发育进化树如图4所示，3个不同省（区）的巴戟天样品可聚成三大分支，其中广东省的5个巴戟天样品聚为一支，自展支持率为78%;广西区的4个巴戟天样品聚为一支，自展支持率为65%;福建省的4个巴戟天样品中南靖2号和南靖1号聚为一支，永定1号和永定2号均单独为一支。

可见，巴戟天遗传结构与地理分布存在一定的相关性，且与psbA-trnH序列相比，基于rDNA ITS序列构建的系统发育进化树可较好地区分广东省和广西区不同地理居群的巴戟天样品。

3 讨论

psbA-trnH和rDNA ITS序列进化速率较快、多态性位点丰富，在中药材领域多用于分子系统树构建和物种鉴别，尤其是近缘属间、属内及种内居群间的遗传差异研究。徐红等（2001）基于rDNA ITS序列，成功构建基于ITS1+ITS2的石斛属植物分子系统树，结果表明该序列在石斛属种内较保守，种间变异较大，可用作黄草石斛分子鉴定的标记。白明明等（2012）基于psbA-trnH序列分析发现，不同地理居群何首乌[Fallopia multiflora（Thunb.） Harald.]遗传特性与地理分布具有一定的相关性。金艳蕾等（2011）基于psbA-trnH和trnL-trnF序列分析头花蓼居群间的DNA序列变异与地理分布的关系，结果发现贵州和云南的头花蓼类群存在明显基因变异。本研究分析不同地理居群巴戟天的psbA-trnH和rDNA ITS序列，并构建其系统发育进化树，结果发现基于rDNA ITS序列和psbA-trnH序列分析结果均在一定程度上揭示不同居群间巴戟天的遗传变异情况，其中，rDNA ITS序列中GC含量高、保守率高、变异率低、简约信息率适中，基于其构建的系统发育进化树可较好地将广东省和广西区不同地理居群的巴戟天样品区分，与丁平等（2012）的研究结论一致。本研究基于psbA-trnH序列构建的系统发育进化树显示，广东省的5个巴戟天样品聚为一支，表明psbA-trnH序列可作为鉴别广东省不同巴戟天居群的分子标记。同样，张宏意等（2018）研究发现，何首乌psbA-trnH序列可作为其道地种源即德庆种源与其他种源分子鉴定的依据。在今后研究中，为准确深入探讨不同居群巴戟天遗传变异与地理分布间的相关性，可以rDNA ITS序列为主，psbA-trnH序列为辅。

4 结论

巴戟天遗传结构与地理分布存在一定的相关性，深入研究巴戟天遗传变异与地理分布间的相关性时应以rDNA ITS序列为主、psbA-trnH序列为辅。

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