桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内可培养细菌分离鉴定及多样性分析

王蕊蕊 胡颖 杨振德 郭春晖 朱林慧 郑霞林 玉舒中

摘要：【目的】明确桉树枝瘿姬小蜂（Leptocybe invasa Fisher & La Salle）体内可培养细菌多样性，为利用微生物防治该害虫打下基础。【方法】利用传统的细菌分离培养与鉴定方法，结合16S rDNA测序和系统发育分析，对刚羽化的桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内可培养细菌进行多样性分析。【结果】从桉树枝瘿姬小蜂体内分离出11株细菌，经鉴定归类于3个门（厚壁菌门、放线菌门和变形菌门）3个纲（芽孢杆菌纲、放线菌纲和γ-变形菌纲）4个目（芽孢杆菌目、微球菌目、乳酸杆菌目和肠杆菌目）8个科（芽孢杆菌科、微杆菌科、葡萄球菌科、乳酸杆菌科、纤维单胞菌科、微球菌科、肠杆菌科和类芽孢杆菌科）8个属（芽孢杆菌属、微杆菌属、葡萄球菌属、片球菌属、纤维单胞菌属、微球菌属、埃希氏杆菌属和类芽孢杆菌属），其中，厚壁菌门（Firmicutes）6株，为优势类群;芽孢杆菌属（Bacillus）3株，为优势菌属。【结论】桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌具有丰富的多样性。

关键词： 桉树枝瘿姬小蜂;雌成虫;可培养细菌;细菌多样性

中图分类号： S718.83                 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2018）12-2432-08

Isolation， identification and diversity of culturable bacteria in female adults of Leptocybe invasa Fisher & La Salle

WANG Rui-rui1， HU Ying1， YANG Zhen-de1，2*， GUO Chun-hui1， ZHU Lin-hui1，

ZHENG Xia-lin3， YU Shu-zhong1

（1College of Forestry， Guangxi University， Nanning  530004， China; 2Guangxi Key Laboratory of Forestry Ecology and Conservation， Nanning  530004， China; 3College of Agriculture， Guangxi University， Nanning  530004， China）

Abstract：【Objective】The diversity of culturable bacteria in Leptocybe invasa Fisher & La Salle was clarified to lay a foundation for microbiological control on the pest. 【Method】Traditional methods of bacterial isolation， culture and identification combined with 16S rDNA sequence and phylogenetic analysis were used for the study on the diversity of culturable bacteria in the female adults of L. invasa that were newly emerged. 【Result】Eleven strains of bacteria were isolated from the sexually matured female L. invasa， belonging to three phyla（Firmicutes， Actinobacteria and Proteobacteria）， three classes（Bacilli， Actinobacteria and Gammaproteobacteria）， four orders（Bacillales， Micrococcales，Lactobacillales and Enterobacterales）， eight families（Bacillacea， Microbacteriaceae， Staphylococcaceae， Lactobacillaceae， Cellulomonadaceae， Micrococcaceae， Enterobacteriaceae and Paenibacillaceae） and eight genera（Bacillus， Microbacterium，Staphylococcus， Pediococcus， Cellulomonas， Microbacterium， Escherichia and Paenibacillus）， among which Firmicutes（six strains） was the dominant bacterium and Bacillus（three strains） was the dominant genus. 【Conclusion】The diversity of culturable bacteria in L. invasa is rich.

Key words：  Leptocybe invasa Fisher & La Salle; female adults; culturable bacteria; bacterial diversity

0 引言

【研究意義】桉树枝瘿姬小蜂（Leptocybe invasa Fisher & La Salle）隶属膜翅目（Hymenoptera）小蜂总科（Chalcidoidea）姬小蜂科（Eulophidae），是一种严重危害桉属（Eucalyptus）植物枝叶的外来入侵致瘿性害虫（Mendel et al.，2004）。该害虫原产于澳大利亚，2000年在中东地区及地中海沿岸国家首次暴发，因其繁殖速度快、世代重叠、暴发期长，现已扩散至亚洲、非洲、欧洲及北美洲等地区的26个国家，给桉树生产造成巨大损失，是目前国际上高度重视的桉树危险性害虫（Zheng et al.，2014）。鉴于昆虫体内细菌对其宿主生长发育、营养代谢、生殖、行为、免疫、抗逆及抗药等发挥的重要作用，同时在害虫防治、昆虫资源开发及生物能源生产等领域展现出巨大的应用潜力（Hosokawa et al.，2016;王四宝和曲爽，2017;张振宇等，2017），因此，研究桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌的组成和多样性有助于进一步探明其体内可培养细菌的功能，为利用微生物防治法控制该害虫提供理论基础。【前人研究进展】近年来，随着微生态学理论及实践范围的不断扩大，有关昆虫肠道微生物的研究日益增多。夏晓峰等（2013）利用传统的微生物培养方法从小菜蛾（Plutella xylostella）3龄幼虫中肠分离得到8株细菌，分属于沙雷氏菌属（Serratia）、肠杆属（Enterobacter）、寡养单胞菌属（Stenotrophomononas）和香味菌属（Myroides）4个属。Nugnes等（2015）利用Wolbachia、Cardinium、Rickettsia、Spiroplasma和Arsenophonus特异性引物分别对雌、雄桉树枝瘿姬小蜂体内微生物总DNA进行PCR扩增，变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析发现只有Rickettsia存在于其体内，并影响桉树枝瘿姬小蜂的生殖能力。刘小改等（2016）对稻纵卷叶螟[Cnaphalocrocis medinalis（Guenée）]4龄幼虫肠道细菌的16S rDNA V3-V4变异区进行测序分析，发现其肠道细菌多样性较丰富，不同样本数量间微生物群落结构和多样性存在明显差异，其中类诺卡氏属（Nocardioides）和鞘脂单胞菌（Sphingomonas）为4个样本的共有优势属。李文丹等（2018）采用16S rDNA文库随机测序法对甜菜夜蛾[Spodoptera exigua（Hübner）]初孵和1日龄幼虫整个虫体、3龄和5龄幼虫中肠细菌进行调查分析，发现甜菜夜蛾中肠存在多种共生细菌，其中不动杆菌属（Acinetobacter）为优势共生菌，且不同的发育时期其共生菌种类与相对丰度存在明显差异。【本研究切入点】目前对桉树枝瘿姬小蜂体内微生物的研究仅采用DGGE分析方法检测其体内是否具有与生殖相关的菌株，而对桉树枝瘿姬小蜂体内细菌群落组成、多样性及各菌株生态功能的研究尚无文献报道。【拟解决的关键问题】桉树枝瘿姬小蜂多为雌性，大多数雌蜂在破瘿出蜂前已携带成熟蜂卵，是一种孤雌生殖昆虫，雄蜂难以捕获。本研究利用传统微生物分离鉴定与16S rDNA序列分析相结合的方法，对桉树枝瘿姬小蜂冬季雌成虫体内可培养细菌进行分离和鉴定，以了解其体内可培养细菌的优势种群及多样性，为更好地开发基于共生关系调控或对内共生菌进行基因改造的“抑菌防虫”生物防治新技术打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试虫源：2017年12月18日采自广西大学林学院教学实验基地露地环境的网棚中[东经108°17′，北纬22°51′;温度（10±1）℃，相对湿度（35±5）%]单株栽培的巨园桉无性系（DH201-2）植株上刚羽化的桉树枝瘿姬小蜂雌成虫。培养基原料、细菌基因组DNA抽提试剂盒、琼脂和Gold View核酸染料及其他分析纯试剂均购自南宁市羽瑞生物试剂经营部，引物（27F和1492R）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，DNA Marker、2×EayTaq PCR SuperMix（+dye）购自北京全式金生物技术有限公司。

1. 2 桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌的分离与纯化

无菌条件下随机选取刚羽化的健康桉树枝瘿姬小蜂雌虫20只，先用无菌水清洗，随后放入75%酒精中进行虫体表面消毒1 min，取出虫体用无菌水清洗残留酒精，转入1‰ HgCl2浸泡3 min后，移至无菌水清洗5～6次，在无菌匀浆器中加入已灭菌的虫体和1.0 mL无菌水，充分研磨制成组织匀浆液，将匀浆液迅速10倍梯度稀释成10-1～10-5，各稀释度取0.1 mL菌液，用无菌涂布棒均匀涂布于NA培养基上，每个稀释度重复10次。在28 ℃恒温培养箱内倒置培养72 h，每隔24 h观察其生长状况，用接种环挑取颜色、形态、大小各不相同的单菌落，在新的NA培养基上进行数次四区划线分离，直至得到纯的单克隆菌株，同时按可数性原则对每个培养基上不同菌落进行计数，将纯化后的菌株接种于NA液体培养基并加入25%甘油于-80 ℃冰箱保存备用。

1. 3 可培养细菌群的鉴定

1. 3. 1 形态学和生理生化特性鉴定 根据《伯杰氏细菌鉴定手册》（布坎南和吉本斯，1984）和《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001）对分离所得的菌株进行菌体形态观察、染色反应、培养性状和生理生化测定。

1. 3. 2 细菌DNA抽提及16S rDNA序列片段扩增 采用细菌基因组DNA抽提试剂盒分别提取所有供试菌株的总DNA，操作步骤按说明进行。以各细菌提取的DNA为模板，使用细菌通用引物：正向引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和反向引物1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增。PCR反应体系30.0 ?L：2× EayTaq PCR SuperMix（+dye）15.0 ?L，27F（32P）0.5 ?L，1492R（32P）0.5 ?L，DNA模板2.0 ?L，ddH2O 12.0 ?L。扩增程序：95 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并使用凝胶回收试剂盒纯化后送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序。

1. 3. 3 16S rDNA序列系统发育分析 将测序所得的16S rDNA序列在EzBioCloud（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon）进行比对，并结合RDP seqmatch和RDP Classifier在線比对分析，确定各菌株属以上的分类单位及同源序列，采用ClustalX程序进行多序列匹配排列，使用MEGA 5.0中的邻位相连Neighbor-joining（NJ）法构建系统发育进化树，各分支的Bootstrap置信度用1000次自导复制评价（Tamura et al.，2011）。

1. 3. 4 桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌多样性分析 细菌多样性分析参数Margalef丰富度指数（D'）、Simpson优势度指数（D）、Shannon-Wiener多样性指数（H'）和Pielou均匀度指数（J）等均用Excel 2013进行计算。

N=[Ni]

D'=[S-1lnN]

D=1-[P2i]

H'=-[PilnPi]

J=H'/lnS

式中，Ni为物种i的个体数，N为群落中所有物种的总个体数，S为物种总数，Pi为物种i的个体数占全部个体数的比例。

2 结果与分析

2. 1 可培养细菌菌体形态和培养性状

通过对桉树枝瘿姬小蜂冬季雌成虫体内可培养细菌的分离、纯化培养，共获得11株不同的单克隆菌株（图1），各菌株形态特征及培养性状见表1。将供试菌株在NA培养基上培养24 h后，按照革兰氏染色法区别11株细菌菌株，结果发现有10株呈革兰氏阳性反应，1株呈革兰氏阴性反应。经油镜观察发现7株菌株为杆状，4株菌株为圆球状;4株有芽孢，7株无芽孢;5株周生鞭毛，6株无鞭毛;所有菌株均有荚膜。

2. 2 可培养细菌的生理生化特性

对11株菌株进行3种碳素化合物、4种氮素化合物和7种酶生理生化特性鉴定，结果（表2）显示，11株菌株均属于糖、醇类发酵型，不产生色氨酸脱氨酶和苯丙氨酸脱氨酶;除N6号菌株外，其余菌株均能产生过氧化氢酶;除N4号菌株外，其余菌株均不产生吲哚。

2. 3 可培养细菌鉴定及多样性分析结果

综合各菌株培养性状、菌体形态、染色反应和生理生化反应等各项指标，共鉴定出8个属，分别为芽孢杆菌属（Bacillus）、微杆菌属（Microbacterium）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、片球菌属（Pedioco-ccus）、纤维单胞菌属（Cellulomonas）、微球菌属（Micrococcus）、埃希氏杆菌属（Escherichia）和类芽孢杆菌属（Paenibacillus）。由表3可知，桉树枝瘿姬小蜂体内各菌株的数量差异较大，其中芽孢杆菌属数量最多。对桉树枝瘿姬小蜂体内细菌多样性进行分析，结果表明，D'=0.62，D=0.65，H'=1.36，J=0.57。因此，桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌多样性丰富，可通过免培养法对桉树枝瘿姬小蜂体内细菌多样性信息进行补充和完善。

2. 4 可培养细菌16S rDNA序列的PCR扩增结果

采用27F和1492R细菌通用引物扩增桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌的16S rDNA序列，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，获得的细菌16S rDNA序列片段如图2所示，均在1500 bp左右。

2. 5 可培养细菌的16S rDNA序列分析结果

将所测得的16S rDNA序列在NCBI数据库中进行BLAST同源性比对，结合RDP数据库Classifier分析，从桉树枝瘿姬小蜂体内分离获得的11株细菌分属于厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria），共涉及8个属，其中3株（N1、N2和N3）属于芽孢杆菌属，2株（N8和N10）属于微球菌属，N5属于葡萄球菌属，N6属于片球菌属，N11属于类芽孢杆菌属，N4属于微杆菌属，N7属于纤维单胞菌属，N9属于埃希氏杆菌属（表4）。可见，16S rDNA序列鉴定结果与综合细菌培养性状、菌体形态、染色反应和生理生化特性等各项指标的鉴定结果基本一致，芽孢杆菌属为优势菌属。

2. 6 可培养细菌的系统发育进化分析结果

将测序得到的桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内可培养细菌的16S rDNA序列进行系统发育进化分析。结果（图3）显示，桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌可归类于8个属，分别在进化树上形成独立的分支，其中芽孢杆菌属、葡萄球菌属、片球菌属和类芽孢杆菌属形成一个以厚壁菌门为家族的大分枝，该4个属的细菌均为芽孢杆菌纲（Bacilli），其中芽孢杆菌属、葡萄球菌属和类芽孢杆菌属分别属于孢杆菌目（Bacillales）的芽孢杆菌科（Bacillaceae）、葡萄球菌科（Staphylococcaceae）和类芽孢杆菌科（Paenibacillaceae）;片球菌属属于乳酸杆菌目（Lactobacillales）的乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）;微杆菌属、纤维单胞菌属和微球菌属形成一个以放线菌门（Actinobacteria）为家族的分支，该3个属的细菌均为放线菌纲（Actinobacteria），分别属于微球菌目（Micrococcales）的微杆菌科（Microbacteriaceae）、纤维单胞菌科（Cellulomonadaceae）和微球菌科（Micrococca-ceae）;埃希氏杆菌属独自形成一个以变形菌门为家族的分支，该属为肠杆菌目（Enterobacterales）的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）。系统发育进化分析进一步支持了RDP Classiffier分类结果。

3 讨论

桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌的系统发育进化分析结果显示，11株细菌中有6株归类于厚壁菌门，4株归类于放线菌门，1株归类于变形菌门，说明在门水平上厚壁菌门和放线菌门是冬季桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌的优势菌群，暗示这两类细菌可能对冬季桉树枝瘿姬小蜂的生长发育、营养代谢及免疫等产生重要影响。在已报道的昆虫如鳞翅目的棉铃虫（Helicoverpa armigera H?bner）（Xiang et al.，2006）、家蚕（Bombyx mori Linnaeus）（相輝等，2007）、贡嘎蝠蛾（Hepjalus gonggaensis Fu & Huang）（刘莉等，2008）、斜纹夜蛾（Spodoptera litura）（孙博通等，2017）及膜翅目蜜蜂属（Apis）（王洪秀等，2017）和鞘翅目的光背天牛（Anoplophora glabripennis）（Schloss et al.，2006）等的肠道优势菌群均为厚壁菌门和变形菌门，说明这两类细菌普遍存在于大多数昆虫体内，且对宿主产生作用。不同昆虫或同种昆虫不同虫态、性别、生境等其体内可培养细菌种类不同，昆虫体内可培养细菌的组成和结构与宿主的种类、食性和环境有着密切联系（魏丹峰等，2017;杨晓晴等，2018）。本研究从桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内只分离到1株变形菌门细菌，可能是越冬时期气温较低，桉树枝瘿姬小蜂生命活动较弱，体内细菌种类较少;也可能是受到培养基和培养条件的限制。

芽孢杆菌属繁殖力强，种群多，能产生抗生素、纤维素酶、细胞壁降解酶、蛋白酶和脂肪酶等，对昆虫消化吸收和防御起到至关重要的作用（周艳玲等，2017）。Douglas（2015）研究发现埃希菌属和葡萄球菌属可参与家蚕的免疫反应;孙博通等（2017）研究表明，微杆菌属具有很强的苯酚降解能力，可抵抗植物有毒次生代谢物质，进而拓展宿主食性范围。茶长卷叶蛾（Homona magnanima）肠道中的葡萄球菌属可抑制入侵宿主体内的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）生长与繁殖（Takatsuka and Kunimi，2000）。类芽孢杆菌属可产生抗菌蛋白、肽类物质及酶活性物质等抗菌物质，具有较强的生防潜力，可能参与宿主的抗逆作用（鲁红学和周燚，2008）。黄翅大白蚁（Macrotermes barneyi）肠道中可培养的纤维单胞菌能以几丁质为唯一碳源生长，且产生较强的木质纤维素降解酶活，说明其体内可培养细菌参与了宿主的营养和消化过程（孙新新等，2017）。本研究在桉树枝瘿姬小蜂冬季雌成虫体内分离到芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、微杆菌属、纤维单胞菌属、葡萄球菌属和埃希菌属等的细菌，但其对宿主是否具有相似的功能有待进一步探究。NA培养基虽然广泛应用于分离培养细菌，但可能有些细菌在特定的培养基上才能生长。因此，要全面了解桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌的种类与数量，还需要选用多种特定的培养基进行分离培养试验。

昆虫体内含有大量的微生物，二者在长期协同进化中已形成了密切的共生关系，且对昆虫的生命活动产生重要影响。探明昆虫体内可培养细菌的种类组成、群落结构及生物功能等信息，有利于了解昆虫的生命活动过程，进而为利用昆虫体内可培养细菌开发生物防治药剂打下理论基础。本研究通过探讨冬季桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌的群落结构组成，可为今后研究体内可培养细菌对桉树枝瘿姬小蜂的生理功能和生态作用打下基础，最终为从微生物角度防治该害虫提供新思路。

4 结论

桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌具有丰富的多样性，主要包括芽孢杆菌属、微球菌属、葡萄球菌属、片球菌属、类芽孢杆菌属、微杆菌属、纤维单胞菌属和埃希氏杆菌属等，其中芽孢杆菌属为优势种群。研究结果可为今后不同细菌间的相互关系及其功能研究提供参考。

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