根腐病病原菌粗提物胁迫下黄芪幼根代谢变化初探

丁文姣 于安芬 李瑞琴 徐瑞 白滨

摘要：为明确黄芪根腐病致病机制，探索感病植株在物质代谢上对毒素的响应，将分离所得茄病镰刀菌毒素粗提物稀释成不同浓度胁迫处理黄芪幼根，对处理后的幼根蛋白质含量进行了测定。结果表明，随着毒素胁迫时间的延长，黄芪幼根蛋白質含量均快速下降，这可能是随着毒素作用时间的延长，破坏了植株体内的正常代谢，进而抑制了蛋白质的合成。毒素胁迫后黄芪幼根可溶性糖含量降低得快，说明植株体内呼吸作用加强;脯氨酸含量则随着胁迫时间和毒素浓度的增加而增加，说明黄芪幼苗对毒素危害表现为敏感响应。

关键词：根腐病菌;粗毒素;黄芪幼苗;物质代谢

中图分类号：S567.23         文献标志码：A         文章编号：1001-1463（2018）12-0031-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.12.010

黄芪根腐病（Astragalus Root Rot）是黄芪的重要病害之一，它是一种分布较广、危害较重、致病的病原种类多和防治困难的常发土传病害，其主要病原菌为镰刀菌，以土壤带菌和植株的病残体进行传播[1  ]。黄芪普遍种植于甘肃各地，尤以甘肃中部的定西等地种植最多，种植面积也不断扩大，轮作周期缩短，连作面积增加，导致黄芪根腐病越来越严重。被根腐病危害的黄芪植株地上部生长衰弱，地下部被害后主、侧根出现褐色坏死病斑，严重时根皮腐烂呈纤维状，直接影响黄芪的产量和品质。我们在对甘肃中部地区黄芪根腐病原的研究中发现，茄病镰刀菌（F. solani）是该区域黄芪根腐病的优势病原菌[2 ]。镰刀菌可产生对植物组织和细胞有明显毒害作用的毒素[3 - 5 ]，脯氨酸和可溶性糖在高等植物的抗逆生理中发挥着重要的作用[6 ]，是在各种生物体内均有分布的渗透保护物质，在毒素胁迫下，高等植物通过增加细胞内的脯氨酸和可溶性糖含量来维持细胞的渗透压。可溶性蛋白质是重要的营养物质，它的增加和积累能提高细胞的抗性，增强细胞对逆境胁迫的抵抗能力[7 - 10 ]。为探明黄芪根腐病优势病菌毒素对黄芪的致病机制毒素与黄芪根系间的互作关系，我们通过用不同浓度黄芪根腐病粗毒素对黄芪幼苗根系苗不同时间处理，然后对幼根可溶性蛋白质、可溶性糖、脯氨酸等3种物质代谢指标的含量进行了研究，以期为进一步从生理生化方面探究其抗病性机制和植株对毒素的响应机制。

1   材料与方法

1.1   供试菌种

供试菌种为前期经分离纯化鉴定所得的黄芪根腐病优势致病菌茄病镰刀菌（F. solani）[11 ]。

1.2   供试植株

选取大小均匀饱满的当年黄芪种子，用90%浓硫酸浸泡 4 min后用流水冲洗 15～30 min，以破除种子硬实现象。将处理后的种子用湿纱布覆盖并置于培养皿中，待种子露白后分别种于装满无菌蛭石的营养钵中，每盆种已露白的种子6～7粒培养。待黄芪出苗、子叶完全展开时，用 1/2 Hoag-land 营养液浇灌，然后每7 d加1次1/2 Hoag-land 营养液，其余时间喷洒蒸馏水保湿。待黄芪幼苗第2片复叶完全展开时选取长势基本一致幼苗供试[12 ]。

1.3   供试培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂12 g、蒸馏水1 000 mL。PSC培养液：蔗糖30 g、硫酸镁0.5 g、蛋白胨10 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸亚铁0.01 g、氯化钾0.5 g、蒸馏水1 000 mL[2 ]。

1.4   试验方法

1.4.1    毒素制备    采用炭吸附法提取病原毒素[13 - 15 ]。将供试菌株在PDA平板上活化7 d，沿菌落边缘打取菌饼（d=5 mm），转接到盛有150mLPSC培养液的250 mL三角瓶内，每瓶10片，置摇床25 ℃下160 r/min 12 h间歇摇动暗培养12d。培养液经纱布过滤后8 000 r/min离心15 min，弃沉淀，留上清液即为培养滤液。在培养滤液中加5%的活性炭置5～6 ℃冰箱内，12 h后用滤纸过滤炭末，然后按体积比1∶10的比例将炭末浸泡于45 ℃热甲醇中1 h后过滤，浓缩甲醇提取液至淡黄色，再将浓缩物溶于50 mL热甲醇中过滤。上清液加3倍体积的氯仿沉淀，移出黄色不溶物，剩下甲醇-氯仿溶解液旋转蒸发至黑色粘稠，即获得粗毒素。用无菌蒸馏水将粗毒素稀释30 倍即为粗毒素母液，再分别配制成0%、25%、50%、100%的粗毒素溶液待用。

1.4.2    黄芪幼苗的处理     取 2～3叶期的黄芪幼苗洗净根部，放入用无菌蒸馏水稀释配制的0%、25%、50%、100%的粗毒素溶液中，置25 ℃ 培养箱培养，分别在第0、 6、12、24 h 时取部分根系，以无菌蒸馏水浸泡的试管苗作为对照，处理好的根系组织保存于-20 ℃冰柜待用。 同时进行植株外观形态的观察记载。

1.5   测定指标与方法

黄芪幼苗根系脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量的测定分别参照张宪政主编的《作物生理研究法》规定的考马斯亮蓝法、蒽酮法、磺基水杨酸法[16 ]。

2   结果与分析

2.1   对黄芪幼根组织蛋白质含量的影响

由图1可见，经毒素处理后黄芪幼根组织蛋白含量呈先升高后下降的趋势。其中，用毒素胁迫处理6 h后，黄芪幼根蛋白质含量略有升高。6～12 h，随着胁迫时间的延长，除100%粗毒素溶液处理黄芪幼苗的可溶性蛋白质仍在升高外，其余处理的可溶性蛋白含量均在降低。12～24 h，各处理可溶性蛋白含量均不同程度降低。这可能是由于植物体内正常的蛋白质合成过程受到抑制，但同时有一些被诱导出的新蛋白出现或原有蛋白质含量的明显增加;后又降低是由于随着毒素作用时间的延长，破坏了植株体内的正常代谢，进而抑制了蛋白质的合成。

2.2   对黄芪幼根组织可溶性糖含量的影响

由图2可见，随着毒素浓度的增加和胁迫处理时间的延长，黄芪幼苗根系的可溶性糖含量25%粗毒素溶液处理呈先降后升再降的趋势;50%、100%浓度处理均呈先下降后上升的趨势。在毒素处理的前期，随着粗毒素液浓度越高可溶性糖含量下降的幅度越大。在毒素处理6 h时，幼苗根系的可溶性糖含量比毒素处理前下降了31.00%～73.67%，这可能是由于可溶性总糖主要参与植物体的呼吸代谢，毒素胁迫后植株体内呼吸作用加强，消耗了可溶性糖。在粗毒素处理12 h后，除25%粗毒素溶液处理下降外，幼苗根系的可溶性糖含量开始缓慢升高，但始终明显低于对照，这可能是因为植株为抵抗毒素的伤害作用，将大量的可溶性糖降解为小分子糖，为抗性代谢提供能量，并且还可以将可溶性糖作为基础物质转化合成为某些抗性物质。

2.3   对黄芪幼根组织脯氨酸含量的影响

由图3可见，毒素处理黄芪幼苗后，初期（0～6 h）幼苗根系的游离脯氨酸含量均快速增加，随着粗毒素液浓度的增大而增虽，即胁迫初期脯氨酸含量与处理浓度呈正相关。中后期（6～24 h）脯氨酸含量变化开始呈现不同趋势，随着处理时间的延长，25%、50%、100%浓度处理脯氨酸含量增加缓慢，而对照脯氨酸含量开始持续降低。毒素胁迫从处理初期开始脯氨酸含量就明显升高，这可能是由于植株感染病菌后，其体内游离脯氨酸含量的大量累积是植株抵御病毒侵染的一种防御反应，脯氨酸含量则随着胁迫时间和毒素浓度的增加而增加，表现了黄芪幼苗对毒素敏感响应。

3   结论与讨论

研究表明，黄芪苗在经过毒素处理后，可溶性蛋白含量均呈先升高后降低的趋势。植物体内可溶性蛋白含量升高可能是在受病菌侵染后形成了对病菌或毒素更稳定、活性更强的同工酶，取代了对毒素或病菌不稳定的酶，结果使它们在病害条件下发挥其特异功能。毒素处理后蛋白质含量下降，可能是由于病原菌所诱导的抗病性生化反应的启动促使可溶性蛋白降解，蛋白质分解加快而合成受到抑制，其分解产物有可能参与抗性物质的合成。可溶性蛋白含量是否可作为驯化黄芪的一个生理指标有待进一步考证。

毒素处理前期时黄芪幼根可溶性糖含量大幅度下降，说明病原菌对黄芪幼苗表现出强致病性。脯氨酸含量则随着胁迫时间和毒素浓度的增加而增加，说明植株体内呼吸作用加强。参照台莲梅等[17 ]的研究可知，抗病品种和感病品种在毒素胁迫后可溶性糖变化趋势不一，故可溶性糖含量的变化趋势可以参考作为驯化黄芪和培育抗性品种的依据之一。脯氨酸是植物受害或在逆境时发生明显变化的一种生化物质，试验结果表明，脯氨酸含量随粗毒素溶液浓度和胁迫时间的增加而增加，说明黄芪幼苗对毒素危害表现为敏感响应。

蛋白质是植物细胞中最重要的有机物质之一，是细胞结构中最重要的成分。植物在逆境条件下通过可溶性蛋白质含量的变化，直接调控其适应逆境的能力，在干旱、盐渍、重金属、病菌侵染等多种逆境胁迫下，植物体内正常的蛋白质合成过程会受到抑制，但同时会有一些被诱导出的新蛋白出现或原有蛋白质含量明显增加。可溶性糖在植物体内主要参与呼吸代谢。在逆境条件下，植株体内游离脯氨酸会增加，它可以清除活性氧自由基，因此对植物起到保护作用，说明毒素可引起叶片细胞内游离脯氨酸含量的升高，使细胞束缚水的能力增强，促进了蛋白质的水合作用，保持蛋白质的空间结构，从而维持细胞膜的正常生理活动，同时也可能表现了黄芪幼苗对致病菌毒素的敏感响应。植株感染病菌后，体内游离脯氨酸含量的大量累积是植株抵御病毒侵染的一种防御反应，并且其增加幅度与抗性正相关，这为以后黄芪驯化培育抗性品种提供了良好的基础。

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（本文责编：杨    杰）