高效液相色谱—蒸发光散射检测器测定黄七胶囊中黄芪甲苷的含量

杜鹏 顿宝生 杨新杰 彭修娟

摘要 目的：评价高效液相色谱-蒸发光散射检测器法（HPLC-ELSD）黄七胶囊中黄芪甲苷的含量测定。方法：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（32∶68）为流动相；蒸发光散射检测器；柱压11.2～12.3 MPa；流速：1.0 mL/min；柱温：室温。理论塔板数以黄芪甲苷峰计算应不低于4 000；峰拖尾因子为1.02。结果：HPLC-ELSD法精密度、重复性、稳定性、回收率良好。黄芪甲苷对照品进样量在1.0528～10.528 μg范围内线性关系良好（r=0.999 9，n=7）。结论：高效液相色谱-蒸发光散射检测器测定黄七胶囊中黄芪甲苷含量是可行的。

关键词 黄七胶囊；高效液相色谱-蒸发光散射检测器法；黄芪甲苷

Abstract Objective：To evaluate contents of astragaloside in Huangqi Capsules measured by HPLC-ELSD. Methods：The octadecyl silane bonding silica gel was the filler， with acetonitrile-water （32∶68） as mobile phase， and the detector was ELSD with the column pressure of 11.2～12.3 MPa and the flow rate of 1.0 mL/min. Column temperature： indoor temperature. Theoretical plate number was calculated by puerarin peak which should not be less than 4 000； Trailing factor was 1.02. Results：The method of HPLC-ELSD had good accuracy， repeatability， stability and recovery rate. A good linearity relationship of the sample size of asreagaloside comparison products in the range of 1.0528-10.528 μg （r=0.999 9， n=7）. Conclusion：Contents of astragaloside in Huangqi Capsules measured by HPLC-ELSD is feasible.

Key Words Huangqi Capsules； HPLC-ELSD； Astragaloside

中图分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.053

中风又名“卒中”，其基本病机为阴阳失调、气血逆乱、上犯于脑，导致脑脉痹阻或血溢脑脉之外，临床以卒然昏仆、不省人事、半身不遂、口舌歪斜、语言不利、偏身麻木为主症的一种疾病[1]。因本病起病急剧，变化迅速，与自然界善行而数变之风邪特性相似，故古人以此类比，名为中风[2]。中风是中医学中的4大顽疾之一，具有发病率高、复发率高、致残率高、病死率高的特点，严重危害人民健康的疾病[3]。中风初发时以风证为主；发病1～2周时，以痰湿证、血瘀证为多；恢复期以血瘀证、气虚证为多[4]。现代血液流变学研究表明，中风患者血液存在着“浓”（红细胞比容增高）、“黏”（全血黏度比、血浆黏度比和纤维蛋白原增高）、“聚”（紅细胞时间性泳时间长）的情况[5]。故益气活血法为中风、特别是中风恢复期的重要治疗法则。

黄七胶囊是在黄七汤的基础上研制而成，由黄芪、土鳖虫、三七、葛根4味药材组成，具有益气活血，化瘀通络之功效。用于气虚血瘀，脉络瘀阻所致的中风恢复期，对半身不遂，肢体麻木，口眼歪斜，言语不清或不语，感觉减退或消失治疗效果良好[6]。方中君药黄芪是一味常用中药，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌之功效。临床用于气虚乏力、食少便溏、中气下陷、久泻脱肛、便血崩漏、表虚自汗、气虚水肿、痈疽难溃、久溃不敛、血虚痿黄、内热消渴，慢性肾炎蛋白尿、糖尿病等[7]。现代研究表明，黄芪皂苷具有减少脑缺血再灌注（I/R）后神经元凋亡[8-10]、降低Ca+超载[11-12]、减少活性氧的损伤[13]、减轻炎性反应[14]、促进修复[15]等作用，在中风恢复期的抗细胞损伤和损伤后修复中发挥重要作用。在新药研制过程中，我们对黄七胶囊中君药黄芪的有效成分—黄芪甲苷的高效液相色谱-蒸发光散射检测器法（HPLC-ELSD）含量测定进行方法学研究，为有效控制黄七胶囊的质量奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 P-3000型高效液相色谱仪；ELSD-UM3000型蒸发光散射检测器；Trisep-2003色谱工作站，7725i进样器。

1.2 试药 10批样品由杨凌无为制药集团公司自制，黄芪甲苷对照品：中国药品生物制品检定所提供，批号：110781-200613，供含量测定用。3批研究用中试样品，批号：20100602、20100605、20100608，由该公司胶囊剂车间生产，乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

2.1.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱压11.2～12.3 MPa；流速：1.0 mL/min；柱温：室温。理论塔板数以黄芪甲苷峰计算应不低于4 000；峰拖尾因子为1.02。

2.1.2 流动相的选择比例 将乙腈-水溶液的比例分别选为（28∶72）（32∶68）（36∶64）（40∶60），按正文方法用对照品溶液精密吸取20 μL，作图，结果表明，乙腈-水溶液（32∶68）为流动相的分离效果最佳。见表1。

2.2 提取溶剂的选择

黄芪甲苷在甲醇和水中有较好的溶解度，试用水、25%、50%、75%、100%的甲醇超声提取，进行比较，选择出最佳的提取溶剂。分别称取样品（批号：20100406）5份，（约2.0 g），精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入水，25%、50%、75%、100%的甲醇100 mL，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）30 min，离心（转速为3 000 r/min），取上清液置蒸发皿中，残渣分别用不同浓度的甲醇或水洗涤3次，每次10 mL，洗液并入蒸发皿中浓缩至干，残渣加水10 mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇液振摇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5 mL使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1.5 cm，长12 cm），以水50 mL洗脱，弃去水液，再用70%乙醇100 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，分别用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。精密吸取对照品溶液10 μL、20 μL与供试品溶液15 μL，注入液相色谱仪测定，以外标两点法对数方程计算，测定结果见表2。

上述结果表明，用50%甲醇提取，黄芪甲苷提取率最高，故选择50%甲醇作为提取溶剂。

2.3 超声时间的确定

分别称取样品约2.0 g（批号：20100406）4份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，分别超声处理（功率250 W，频率35 kHz）15、30、45、60 min，测定结果见表3。

上述结果表明，超声45 min提取效果最佳，故超声提取时间确定为45 min。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取浓度为0.5264 mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液2、4、8、12、18、20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以Ln峰面积（Y）为纵坐标，Ln含量（X）为横坐标，求得2点对数方程：Y=1.374 38X+9.90402，r=0.999 9，n=7。见表4。结果表明，黄芪甲苷进样量在1.052 8～10.528 2 μg范围内线性关系良好。

2.5 稳定性试验

取本品（批号20100406）精密称定，按正文中供试品制备方法制备样品，于0、4、8、12、24 h按正文方法测定，即得。结果表明，本品溶液在24 h内稳定。见表5。

2.6 精密度试验

取对照品溶液，在正文色谱条件下重复进样5次，记录峰面积，结果见表6。表明本方法精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一批号样品（批号：20100406）6份，按正文中供试品溶液制备方法制备，按正文方法测定含量，结果表明，本方法重复性良好。见表7。

2.8 回收率试验

取已知含量的样品（批号：20100406，含量为0.6427 mg/粒）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入黄芪甲苷对照品溶液（浓度为0.596 4 mg/mL）2 mL，加入50%甲醇98 mL，以下皆同正文，依正文方法测定，以下式计算回收率：

回收率（%）=测得总量（mg）-已知样品含量（mg）加入对照品的量（mg）×100%。

结果表明，本方法回收率良好。见表8。

2.9 样品测定

按处方量的1/10，分别制备7批样品，连同成型工艺研究试验的3批样品，依据正文中含量测定方法，进行含量测定，结果见表9，经对10批样品中黄芪甲苷的含量测定，平均值为0.64 mg/粒，考虑到药材来源及大工业生产、贮藏等因素，故暂定本品每粒含黄芪甲苷（C41H68O14）不得少于0.52 mg。

2.10 验证实验

采用黑龙江产的蒙古黄芪投药，制得的3批中试样品，批号：20100602、20100605、20100608，对该黄七胶囊中黄芪所含黄芪甲苷进行了含量测定。另外，在该处方中取掉黄芪，按正文生产工艺投料制作，制成阴性对照品，分别进行含量测定，结果见表10。

以上3批中试样品均符合规定，平均测得值为0.644 mg/粒，含量测定成分黄芪甲苷的转移率为93.33%，证明该标准所指定的黄芪甲苷含量限度可行，阴性对照品在相应部位未出峰，证明处方中其他药材对本含量测定无干扰。见图1。

3 讨论

在提取溶剂的选择试验中，以外标两点对数方程计算，用Ln峰面积/Ln称样量为筛选指标，优选出了最佳提取溶剂为50%甲醇，优于中华人民共和国药典2010年版一部黄芪药材中黄芪甲苷含量测定用甲醇作为提取溶剂[5]。

中华人民共和国药典对黄芪药材中黄芪甲苷含量测定采用索氏提取器，加热回流提取4 h，本实验采用超声提取45 min，提取效果最佳，大大节省了提取时间，降低了能量的消耗。

HPLC-ELSD法簡便、灵敏、准确。精密度、重复性、稳定性、回收率及线性关系良好。黄芪甲苷的含量测定常采用薄层扫描法，但重现性差，且黄芪甲苷只在201 nm处呈现弱的末端吸收，若采用紫外（UV）检测器测定，干扰非常严重。本实验采用蒸发光散射（ELSD）检测器，对黄芪甲苷有通用响应，能有效的排除干扰。

在本实验条件下，稳定性、精密度、重复性、线性关系良好，平均回收率为98.90%（RSD=0.40%），经10批样品及3批中试样品验证实验，证明该标准所制定的黄芪甲苷含量限度可行，阴性对照品在相应部位未出峰，说明处方中其他药材对本含量测定无干扰。

参考文献

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