HPLC—QAMS法测定不同产地19批山茱萸中5种环烯醚萜苷类成分的含量

孙玲 樊晓兰 戴小丽

摘 要 目的：测定不同产地19批山茱萸中5种环烯醚萜苷类成分的含量。方法：采用高效液相色谱（HPLC）-一测多评（QAMS）法。色谱柱为Agilent XDB-C18，流动相为甲醇-水，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为15 μL，检测波长为240 nm。以山茱萸中的马钱苷为内参物，建立其与山茱萸中另外4种环烯醚萜苷类成分即莫诺苷、当药苷、山茱萸苷和山茱萸裂苷之间的相对校正因子并进行适用性评价后计算4种成分的含量；另采用HPLC-外标法测定19批药材中上述5种成分的含量，比较两种方法测定结果的差异，验证QAMS法的准确性。结果：在适用性评价中，不同试验条件下4种成分的相对校正因子的RSD均小于2%；两种测定方法下，4种成分的含量比较差异均无统计学意义（P均大于0.05）。结论：本研究建立的HPLC-QAMS法可用于山茱萸中5种环烯醚萜苷类成分的含量测定，且方法准确、可靠、快速，成本更低。

关键词 高效液相色谱法；一测多评法；山茱萸；环烯醚萜苷类；外标法；马钱苷；含量测定

ABSTRACT OBJECTIVE： To determine the contents of 5 iridoid glycosides in 19 batches of Corni fructus from different origins. METHODS： HPLC-QAMS method was adopted. The determination was performed on Agilent XDB-C18 column with mobile phase consisted of methanol-water （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 35 ℃， and sample size was 15 μL. The detection wavelength was set at 240 nm. Using loganin in Corni fructus as internal standard， relative correction factors （RCF） of loganin to other 4 iridoid glycosides as monod glycosides， officinosides， cornus glucosides and cornus glucosides were established. The contents of 4 kinds of components were calculated after suitability evaluation. The contents of 5 kinds of components in 19 batches of samples were determined by HPLC external standard method. The differences of two methods were compared； the accuracy of QAMS was validated. RESULTS： RSDs of RCF for 4 components under different trial conditions were all lower than 2% in suitability evaluation. P value of content comparison of 4 components between 2 methods were all higher than 0.05. CONCLUSIONS： HPLC-QAMS method can be used for content determination of 5 iridoid glycoside in Corni fructus. It is accurate， reliable， rapid and less costly.

KEYWORDS HPLC method； QAMS method； Corni fructus； Iridoid glycosides； External standard method； Loganin； Content determination

中藥山茱萸为山茱萸科植物山茱萸（Cornus officinalis Sieb. et Zucc.）的干燥成熟果肉，是一种常用的补益中药，其味酸涩、性微温，有温补肝肾、固涩精气之功效，用于眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴等症[1]，其主要产地有陕西、河南、浙江、山西等地，另外在安徽、四川等地也有部分种植。

已有研究从山茱萸中分离得到了环烯醚萜类、三萜类、鞣质类、黄酮类、有机酸及其酯类、糖类，以及蛋白质、氨基酸、维生素、挥发性成分和矿物质元素等[2]。其中，环烯醚萜苷类成分是山茱萸药材中的一类重要成分，具有消炎、抗癌、防衰老、抗氧化、降血糖、强心、免疫调节活性等作用，主要活性成分包括莫诺苷、当药苷、山茱萸苷、马钱苷、山茱萸裂苷等十余种[3]。因此，同步测定山茱萸中多个环烯醚萜苷类成分可以全面有效地评价山茱萸药材的质量。但由于对照品价格昂贵等原因，在实际药材生产和监测中难以做到通过多指标测定来控制山茱萸的药材质量。一测多评（QAMS）法是通过建立药材中不同成分间的相对校正因子，测量药材中其中一种成分的含量，进而计算出其余成分的含量，以实现对药材中多个质量指标的测量的方法，该法已在白木通、三七、黄芩、柴胡等药材中得以验证[4-9]。

故本研究采用高效液相色谱（HPLC）-一QAMS法，以价格便宜、测定技术成熟的马钱苷为内参物，建立其与莫诺苷、当药苷、山茱萸苷和山茱萸裂苷等环烯醚萜苷类成分之间的相对校正因子，进而可以通过测定山茱萸中马钱苷一种成分的含量，快速计算出其余4种环烯醚萜苷类成分的含量，以实现对山茱萸药材中多个环烯醚萜苷类成分含量的同步测定。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1200 HPLC仪，包括G1311A四元泵、G1313A 自動进样器、G1316A 柱温箱和Agilent Chem Station工作站（美国Agilent公司）；Dionex P680 HPLC仪，包括P680A 四元梯度泵，TCC-100柱温箱和Chromeleon色谱工作站（美国Dionex公司）；AL-204电子分析天平、AE240 1/10万电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；L535-1低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；KQ-500DE 数控超声波清洗器（ 昆山市超声仪器有限公司）；DZF-6053 电热真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；FW400A 高速万能粉碎机（ 北京科伟永兴仪器有限公司）；色谱柱有Agilent XDB-C18、Ultimate XB C18、Diamonsil C18、Kromasil C18，规格均为250 mm×4.6 mm，5 μm。

1.2 药品与试剂

研究用19批山茱萸药材分别于2016年9-10月采自浙江、安徽、四川、河南、陕西、山西等地，经笔者本人鉴定为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉（使用时将果肉置于45 ℃恒温箱中烘干，取出，粉碎、研磨，过4号筛，得山茱萸粉末，5 ℃干燥保存备用）；莫诺苷对照品（批号：111998-201602）、当药苷对照品（批号：111742- 200501）、马钱苷对照品（批号：111640-201606）均购自中国食品药品检定研究院；山茱萸苷对照品（批号：201602）、山茱萸裂苷对照品（批号：201605）均购自上海亿欣生物科技有限公司，上述5种对照品经峰面积归一化法计算，纯度均大于98%；甲醇为色谱纯，水为高纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 QAMS法基本原理

在一定的线性范围内，成分的量（质量或浓度）与检测器响应值成正比，即f=W/A（W为浓度等，A为响应值，f为响应因子）。在多指标质量评价时，以药材中某一典型组分（有对照品供应者）为内参物，建立该组分与其他组分之间的相对校正因子，通过校正因子就可计算其他组分的含量。这种通过测定一个成分可实现对多个成分定量的方法即为QAMS法。

假设某样品中含有i 个组分，fi=Wi/Ai（i=1，2，…，k，…，m），式中Ai为组分i峰面积，Wi为组分i的量。选取其中一个组分k为内参物，建立组分k与其他组分m之间的相对校正因子（fkm）=fk/fm=（Wk×Am）/（Wm×Ak）；由此可导出定量计算公式：Wm=（Wk×Am）/（fkm×Ak）；式中Ak为内参物峰面积，Wk为内参物的量，Am为其他组分m的峰面积；Wm为其他组分m的量。

2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0～10 min，18%～20%A，11～20 min，27%～30%A，21～35 min，32%～35%A）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：15 μL；检测波长：240 nm。在上述色谱条件下，取“2.3”项下的混合对照品溶液和供试品溶液（产地：浙江淳安）进样分析，结果各待测峰间及与相邻峰间的分离度均大于1.5，表明系统适用性良好。2种溶液的色谱图见图1。

2.3 溶液的制备

2.3.1 混合对照品溶液

称取莫诺苷、当药苷、山茱萸苷、马钱苷和山茱萸裂苷对照品适量，精密称定，分别为49.58、3.81、2.03、32.28、17.36 mg。取上述对照品分别置于10 mL量瓶中，加75%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密吸取上述对照品溶液各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加75%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液，5 ℃保存，备用。

2.3.2 供试品溶液

精密称取山茱萸干燥粉末0.5 g，放入圆底烧瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，摇匀，称定质量；室温超声（功率：1 100 W，频率：40 kHz）提取30 min，再次称定质量，用75%甲醇补足损失的质量，室温下离心（4 000 r/min、半径17 cm）5 min，取上清液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，续滤液即为供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系与定量限考察

精密吸取“2.3.1”项下混合对照品溶液1、6、10、14、18、20 μL，注入色谱仪中，每个浓度进样3次，取平均值。以进样量为横坐标（x，μg）、峰面积积分值为纵坐标（y）绘制标准曲线并进行回归计算，得莫诺苷、当药苷、山茱萸苷、马钱苷、山茱萸裂苷的标准曲线回归方程及线性范围；再按要求计算各成分的定量限。结果表明，各对照品进样量与峰面积积分值间均具有良好的线性关系。5种成分的线性关系与定量限考察结果见表1。

2.4.2 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液15 μL，连续进样6次，测定待测成分的峰面积，计算RSD。结果，莫诺苷、当药苷、山茱萸苷、马钱苷、山茱萸裂苷峰面积的RSD分别为 0.49%、1.53%、1.33%、1.71%和0.64%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验

精密吸取同一供试品（产地：浙江淳安）溶液15 μL，分别于制备后的0、2、6、12、18、24 h ，按“2.2”项下色谱条件进样测定峰面积。结果显示，待测成分莫诺苷、当药苷、山茱萸苷、马钱苷、山茱萸裂苷峰面积的RSD分别为0.76%、1.16%、0.58%、1.35%和1.77%（n=6），表明供试品溶液中5种成分在24 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验

将同一产地（产地：浙江淳安）的山茱萸干燥粉末，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.2”项下色谱条件进样测定峰面积，计算5种成分的含量。结果显示，莫诺苷、当药苷、山茱萸苷、马钱苷、山茱萸裂苷含量的RSD分别为1.73%、1.05%、1.21%、0.96%和1.33%（n=6），表明本试验方法重复性良好。

2.4.5 准确度试验

精密称取0.25 g已知各成分含量的山茱萸干燥粉末6份，分别加入一定量的对照品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定峰面积，计算加样回收率。结果表明，本试验方法准确度良好，加样回收率试验结果见表2。

2.5 HPLC-QAMS法的建立

2.5.1 相对校正因子的测定

取“2.3.1”项下的混合对照品溶液，分别以不同的进样量（1、6、10、14、18、20 μL）进样测定。以山茱萸中的马钱苷为内参物，按照公式fkm=fk/fm=（Wk×Am）/（Wm×Ak）分別计算山茱萸中莫诺苷、当药苷、山茱萸苷和山茱萸裂苷的相对校正因子，结果见表3。

2.5.2 QAMS法的耐用性评价

（1）不同HPLC仪和色谱柱对校正因子的重现性考察。取“2.3.1”项下制备的混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件分别进样6次，每次15 μL，考察Agilent 1200 HPLC仪、Dionex P680 HPLC仪，以及不同色谱柱Kromasil C18、Ultimate XB C18、Diamonsil C18时的相对校正因子。结果显示，不同色谱系统对相对校正因子的影响较小（RSD<2%，n=6），重现性良好，详见表4。

（2）不同流速对相对校正因子的影响。精密吸取“2.3.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.2”项下的色谱条件进样，分别测定流速在0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mL/min时的相对校正因子。结果，莫诺苷、当药苷、山茱萸苷和山茱萸裂苷相对校正因子的RSD依次为0.93%、1.75%、1.16%、1.83%（n=6），均<2%，表明流速对相对校正因子值影响较小。

（3）不同柱温对相对校正因子的影响。精密吸取“2.3.1”项下混合对照品溶液15 μL，按“2.2”项下的色谱条件进样，分别测定柱温在20、25、30、35、40、45℃时的相对校正因子。结果，莫诺苷、当药苷、山茱萸苷和山茱萸裂苷相对校正因子的RSD分别为1.18%、1.52%、0.93%、0.76%（n=6），均<2%，表明柱温对相对校正因子影响较小。

（4）不同进样量对相对校正因子的影响。精密吸取“2.3.1”项下混合对照品溶液各15 μL，按“2.2”项下的色谱条件进样，分别测定在2、5、10、15、20、25 μL进样量时的相对校正因子。结果，莫诺苷、当药苷、山茱萸苷和山茱萸裂苷相对校正因子的RSD依次为1.18%、1.57%、1.16%、1.82%（n=6），均<2%，表明进样量对相对校正因子值影响较小。

2.5.3 待测成分色谱峰的定位

精密吸取“2.3.1”项下混合对照品溶液15 μL，在2种色谱仪（Agilent 1200和Dionex P680）中，分别采用3种不同填料色谱柱（Kromasil C18、Ultimate XB C18和Diamonsil C18），测定并计算莫诺苷、当药苷、山茱萸苷和山茱萸裂苷与内参物马钱苷间色谱峰的相对保留值和保留时间差。结果，各待测成分间的相对保留值波动较小，其RSD分别为1.81%、1.25%、1.69%、1.72%（n=6），所以采用相对保留值法用于山茱萸环烯醚萜苷类成分QAMS法的定位。不同仪器及不同色谱柱时4种成分的相对保留值比较结果见表5。

2.6 QAMS法与外标法测定结果的比较

按“2.3.2”项下方法，取19批不同产地的山茱萸干燥粉末制备成供试品溶液。精密吸取各批供试品溶液15 μL，注入色谱仪测定，通过QAMS法计算各成分含量。同时采用外标法对山茱萸中5种环烯醚萜苷类成分进行多成分同步含量测定，结果见表6。

表6结果表明，山茱萸药材中莫诺苷、马钱苷的含量相对较高，当药苷和山茱萸苷的含量较低；同时不同产地山茱萸药材中5种环烯醚萜苷类成分含量差异较大，莫诺苷的含量范围约为9.797～18.093 mg/g、当药苷为0.415～1.180 mg/g、山茱萸苷为0.318～0.561 mg/g、马钱苷为6.627～11.036 mg/g、山茱萸裂苷为2.550～5.462 mg/g。将两种测定方法所得数据结果经SPSS 22.0软件采用t检验及非参数检验分析。结果，莫诺苷、当药苷、山茱萸苷和山茱萸裂苷的QAMS法计算值与外标法实测值的P值分别为0.667、0.329、0.812、0.759，均>0.05，表明两种方法测得的结果无显著性差异，提示建立的相对校正因子具有较好的可信度，QAMS法计算结果可靠。

3 讨论

3.1 内参物的选择

在2010年版[10]和2015年版《中国药典》中，均将马钱苷作为山茱萸质量评价的指标性成分，其对照品廉价较易获得，并且测定条件和技术成熟。因此，本研究将马钱苷选为内参物，构建其与其他4种环烯醚萜苷类成分间的相对校正因子，用于计算其他成分的含量。

3.2 测定波长的选择

在预试验中，笔者对供试品溶液和混合对照品溶液在190～400 nm波长范围内进行全波长扫描。结果，莫诺苷、当药苷、山茱萸苷、马钱苷和山茱萸裂苷的最大吸收波长分别为240、240、237、240、221 nm，山茱萸苷在240 nm波长处与237 nm波长处的峰面积差异较小，山茱萸裂苷在240 nm波长处也有较大紫外吸收。因此，本试验采用240 nm为检测波长。试验结果表明，此波长下各待测峰分离度良好。

3.3 样品处理方法

在前期试验中，根据文献资料[11-13]，笔者分别考察了以不同体积分数的甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯为提取溶剂，采用加热回流法和超声提取法制备供试品溶液的情况，最终确定了采用75%甲醇溶液超声提取30 min的方法，且该方法操作简单、目标成分的提取效率高、各待测峰峰面积较大、干扰的杂质峰较少。

3.4 耐用性评价

在对建立的相对校正因子进行适用性评价时，考察了在不同液相色谱仪、不同色谱柱、不同柱温、不同流速和不同进样量时的相对校正因子，结果其RSD均<2%，提示以上因素对相对校正因子没有显著影响，表明建立的相对校正因子具有较好的适用性；而后通过峰面积相对保留值和保留时间差这两种方法对色谱峰的位置进行了确定，结果显示相对保留值法更适用于山茱萸中环烯醚萜苷类成分的含量测定。最后检验QAMS法计算值与外标法实测值的差异，结果二者P值均>0.05，提示两组数据间比较差异无统计学意义，表明在缺少对照品的情况下，可以利用QAMS法对山茱萸药材中的多种环烯醚萜苷类成分进行定量测定。

3.5 结果分析

通过对19批药材含量测定结果进行分析，表明山茱萸药材中5种环烯醚萜苷类成分含量受地域影响较大，在评价山茱萸药材质量时应考虑其产地因素。但在试验过程中笔者也发现同一产地的不同批次山茱萸药材中5种环烯醚萜苷类成分含量也存在一定差异，这可能与药材的采收时间、农户种植水平等因素有关，具体原因还有待进一步的试验考察。

综上，本研究建立了同时测定山茱萸中5种环烯醚萜苷类成分含量的多指标评价的HPLC-QAMS法，实现了快速、全面、准确地评价山茱萸药材质量的要求，且检测成本低，为中药中多组分的质量评价标准的建立提供了一定的参考。

参考文献

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（收稿日期：2017-10-30 修回日期：2018-01-19）

（编辑：刘 萍）