针刺对脑出血急性期血肿周围脑组织中凋亡细胞及其百分率影响的时效关系

郑笑男 张铎 李平

摘要 目的：通过观察针刺对脑出血模型大鼠血肿形成后不同时间的血肿周围脑组织凋亡细胞及其百分率影响，研究针刺作用及其时效性的相关保护机制。方法：采用Wistar大鼠尾状核自体血缓慢注入法制作脑出血模型。脑组织细胞凋亡率测定分别应用TUNEL法及流式细胞术。结果：脑出血急性期TUNEL阳性细胞率显著升高，针刺各组均偏低，但高于假手术组，且针刺干预越早该比率越低；流式细胞检测结果基本与其一致。结论：针刺治疗能够改善脑出血急性期所造成的血肿周围脑组织相关的凋亡情况，从而在脑出血急性期起到保护脑组织的作用，且脑出血发生后针刺干预越早疗效越好。

关键词 针刺；脑出血急性期；实验性脑血肿；细胞凋亡；TUNEL法；流式细胞术；脑保护机制；时效关系

Abstract Objective：To study the protection mechanisms of function and time-effect relationship of acupuncture method by observing apoptotic cell in cerebral hemorrhage model rats′ brain tissue around hematomas and its percentage effects at different times in acute cerebral hemorrhage.Methods：The Wistar rats model of ICH were established by infusing autologous blood into caudate nucleus through stereotaxis technique.Apoptosis rate of brain tissue was analyzed by Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） and flow cytometry （FCM） methods.Results：TUNEL positive cell percentage had a significant rise at acute stage of ICH，yet the rates tended to reduce in all the groups，which was higher than that in sham-operated group，and higher acupuncture intervention with lower percentage.The result of FCM was basically consistent with it.Conclusion：Acupuncture treatment is able to ameliorate the apoptosis of brain perihematoma tissues of rats with ICH so as to protect the brain tissue from acute stage of ICH.And the earlier acupuncture intervention，the better curative effect will achieve.

Key Words Acupuncture； Acute stage of cerebral hemorrhage； Experimental cerebral hemorrhage； Apoptosis cells； TUNEL； FCM； Cerebral protection mechanisms； Time-effect relationship

中圖分类号：R245文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.044

脑出血，是指原发性非外伤性脑实质内出血，是急性脑血管疾病中的危重类型，也是严重危害人类健康的4大疾病之一，并有较高的发病率、死亡率、致残率与较多的并发症，且很多研究已经证实：它和高血压病、高脂血症、代谢综合征等疾病有着密不可分的关联。关于脑出血的病理生理机制较为复杂，尚未彻底阐明。目前比较公认的几个重要病理环节例如血肿周围脑组织内Ca+超载、兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸失稳态以及神经兴奋性毒性作用的发生等。有研究已表明，凋亡机制参与了脑出血后继发性神经元损伤的过程，且于凋亡机制中，以上提到的相关关键病理环节发挥了主导性的作用。

细胞凋亡，自从1972年被发现[1]以来，一直是细胞死亡研究领域的焦点话题。它是指为维持内环境稳定，由基因调控的细胞自杀过程。传统意义上，细胞死亡包括细胞坏死与细胞凋亡，而二者大不相同，前者是无序变化的被动过程，且坏死细胞会发出危险信号，并引发炎性反应，对邻近组织造成严重损害[2]；后者是有序变化的主动过程，涉及一系列基因的活化、表达及调控等的作用，但凋亡本身不属于病理状态下的自体损伤，而是为能更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程[3]，其生理影响及临床意义具有重要的研究价值[4]。凋亡细胞有其独特形态和生化特征：细胞核染色质固缩，DNA广泛降解断裂；细胞全面皱缩，细胞膜皱缩外突、包裹线粒体等细胞器、核片段形成凋亡小体[5]。细胞凋亡过程的详细机制尚不完全明了，但总体上可以分为起始和效应2个阶段。细胞凋亡的起始阶段是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列开关的开启或关闭；而凋亡一旦进入效应阶段则不可逆转，最终导致细胞死亡。细胞凋亡与许多学科都有着密切的联系，包括发育生物学、免疫学与临床医学等。从临床医学角度而言，许多疑难病症[6-14]的发病机制如血液病、艾滋病、肿瘤、自身免疫性疾病、胶原病、脑血管障碍、心血管疾病、肝脏疾病、皮肤病等均可通过细胞凋亡机制被揭示[15]。

近些年来，中医治疗比如针灸疗法在脑出血治疗的应用已是非常广泛，且已取得了相当不错的效果，因而它已成为整个脑出血治疗体系中尤其是康复过程中不可或缺的一部分内容。如醒脑开窍针刺法或石氏中风单元疗法的应用。有关脑出血分期的界定，一般划分为4个阶段：超急性期（发病后24 h之内）、急性期（发病后48 h至7 d）、亚急性期（发病后8 d至4周）、慢性期（发病后>4周）。许多患者从脑出血发病之刻起到开始接受临床诊治之时已经过了超急性期，所以急性期的诊治显得格外重要。本实验选择较权威的醒脑开窍针刺法中的2个主穴：双侧内关穴、人中穴，共同发挥醒脑开窍，疏通经络的功效，以期为进一步提高脑出血疗效和脑出血患者的生命质量，减轻患者家庭与社会的负担做出贡献。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用健康成年雄性Wistar大鼠135只，SPF级，体质量215～245 g，由中国医学科学院生物医学工程研究所提供。

1.1.2 毫针 不锈钢毫针：苏州东邦医疗器械有限公司。

1.1.3 试剂与仪器 原位细胞检测试剂盒：美国ROCHE公司（货号：11684817910）；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒：美国BD公司（货号：556547）；流式细胞仪：美国BD公司accuri C6型。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 大鼠按随机数字表随机分为假手术组、模型组和针刺组。针刺组和模型组又按照随机数字表将其随机各分为4个亚组，每亚组均为15只，共60只；假手术组为15只。实验过程中，共有10只大鼠因死亡而被剔除：假手术组1只；3 h模型组2只，9 h模型组1只，24 h模型组2只，48 h模型组2只；9 h针刺组1只，24 h针刺组1只。

采用Wistar大鼠尾状核自体血缓慢注入法制作脑出血模型。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（300 mg/kg），先使生理盐水湿润大鼠头部两耳间毛，后用刀片将其刮去。备皮后将大鼠以俯卧位固定在单臂脑立体定位仪上，参照《大鼠脑立体定位图谱》[16]定位，前、后囟在同一水平面，然后将其门齿固定于门齿钩上，同时调整好耳杆及仪器坐标。头部正中纵行切口，暴露前囟和冠状缝，在冠状缝前2 mm、中线右旁开4 mm处用直径1 mm手钻人工钻开颅骨，将25 μL微量进样器针头插在脑内6 mm至尾状核处，缓慢（5 min）注入25 μL自体全血（断尾，轻轻捋尾，用抗凝管取血），留针5 min后退针。最后用无菌骨蜡封闭钻孔并缝合头皮，再用碘伏消毒液消毒创口。大鼠麻醉术后苏醒，造模成功（预实验结果采用Bederson评分法[17]和Longa评分法[18]评定行为学变化已经证实），归笼饲养。Bederson评分法：轻抓大鼠尾巴，提起大鼠高于桌面10 cm，正常大鼠前爪伸直，0分：没有神经功能缺损；1分：脑部病变对侧腕关节、肘关节屈曲，肩内收屈曲；2分：上述体征阳性，向麻痹侧推阻力下降；3分：活动时向麻痹侧打圈（呈追尾状）。Longa评分法：0分：没有神经功能缺损；1分：瘫痪侧前爪不能完全伸展；2分：行走时，大鼠向瘫痪侧转圈；3分：行走时，大鼠身体向瘫痪侧倾倒；4分：不能自发行走，有意识丧失。评分在1分以上（包括1分）即为造模成功。模型组及针刺组复制脑出血模型，假手术组模拟手术创伤过程于尾状核注入相同体积生理盐水。

1.2.2 干预方法 针刺组于造模成功后3 h、9 h、24 h、48 h开始针刺，针刺2次/d（间隔6 h），连续针刺5 d后处死；模型对照组亦于造模成功后3 h、9 h、24 h、48 h开始模拟针刺组的捉抓过程，捉抓2次/d，连续捉抓5 d后处死；假手术组于手术后3 h开始模拟针刺组的捉抓过程，捉抓2次/d，连续捉抓5 d后处死。各组大鼠处死后立即断头取脑，观察相应指标。

大鼠腧穴定位根据中国针灸学会实验针灸研究会制定的《动物针灸穴位图谱》，针刺组选取双侧内关穴、人中穴。针具选用31号、1.5寸不锈钢毫针。内关穴运用透刺法，接电针治疗仪，选用连续波，留针1 min；人中穴应用雀啄法强行刺激10次，不留针。

1.2.3 检测指标与方法 脑组织细胞凋亡率测定分别应用TUNEL法及流式细胞术。

1.3 统计学方法 所得数据采用SPSS 17.0软件进行处理，定量分析应用单因素方差分析（One-way ANOVA），等级评估采用秩和检验（Wilcoxon）。数据均以平均值±标准差（±s）进行表示。显著性水准为α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TUNEL细胞凋亡检测 若将组间数据进行比较，假手术组TUNEL阳性细胞率最低；与假手术组比较，同时间模型组和针刺组的TUNEL阳性细胞率明显增高，尤其是同时间模型组增高最明显，假手术组、同时间模型组、同时间针刺组3者比较，差别皆有统计学意义（P<0.05）。针刺各亚组之间为48 h针刺组TUNEL阳性细胞率最高，与其余各亚组比较，差别均有统计学意义（P<0.05）；9 h针刺组较之24 h针刺组，差异无统计学意义（P>0.05）；而3 h针刺组分别较9 h针刺组及24 h针刺组的TUNEL阳性细胞率明显降低，且差异有统计学意义（P<0.05）。见表1、图1。

在高倍镜下，大鼠脑出血急性期血肿周围脑组织TUNEL染色阳性细胞的胞核被染为棕褐色，且形态、大小各异，另有少量胞核被淡染为棕黄色，其以散在的形式不均匀地分布于正常细胞之间。假手术组偶见阳性细胞；模型各亚组阳性细胞显著增多；针刺各亚组阳性细胞较假手术组仍增多，但较之对应时间点模型各亚组显著减少。见图2。

2.2 流式细胞术检测 假手术组细胞凋亡率最低；与其相比，同时间模型组的细胞凋亡率明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；相对而言，同时间针刺组的细胞凋亡率也较高，唯有24 h针刺组、48 h针刺组2者分别与假手術组比较，差异有统计学意义（P<0.05），而3 h针刺组和9 h针刺组2者分别与假手术组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；针刺组各亚组与同时间模型组比较，细胞凋亡率显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。针刺各亚组之间为24 h针刺组和48 h针刺组细胞凋亡率较高，但2者之间差异无统计学意义（P>0.05），3 h针刺组和9 h针刺组细胞凋亡率较低，且2者分别与24 h针刺组、48 h针刺组比均，差异有统计学意义（P<0.05），3 h针刺组、9 h针刺组2者之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表2、图3、图4。

3 討论

在脑出血发生后的急性期，脑细胞即会进入细胞凋亡的起始阶段，包括外始式和内始式2种途径[19]。现普遍认为，外始式途径又被称为外源性死亡受体途径，它始于肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）受体家族与配体的结合。当脑组织缺血缺氧时，其相应配体如凋亡相关因子配体（Fas ligand，Fas-L）和TNF等皆上调[20]，引发半胱天冬酶原-8（Procaspase-8）通过高密度自催化激活自身产生半胱天冬酶-8（Caspase-8），后随即诱导Caspase级联反应[21]。内始式途径亦被称为内源性线粒体途径，它源于肿瘤抑制基因如p53，当细胞DNA受到损伤时会被激发，此时p53表达并诱发对细胞凋亡前产生作用的Bcl-2家族成员如Bax等的表达上调及Bcl-2等的表达下调，它们共同作用于细胞线粒体，导致线粒体内外膜间物质细胞色素C释放至细胞质[22]。继而在细胞质中由细胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子（Apoptosis protease-activating factor-1，Apaf-1）及Procaspase-9共同组成的凋亡复合体形成，即Caspase-9的激活状态，后诱导Caspase级联反应[23]。在细胞凋亡的效应阶段，Caspase-3等蛋白酶是整个过程的主要诱导物，它们受上一阶段2种途径已活化的Caspase-8或Caspase-9诱导激活，通过降解细胞骨架和DNA片段等方式最终导致细胞的死亡[24]。

许多研究已证明，针刺对于细胞凋亡及其百分率具有良好的抑制作用。Feng R等[25]对电针应用到缺血性脑卒中时所发挥的神经保护作用进行了综述和总结，阐明电针能够减少脑卒中后所带来的脑损伤，同时可以在脑卒中未发病时诱导发生脑缺血耐受，而这些积极作用是通过促进血管生成、减轻炎性反应、调节BBB、抑制细胞凋亡等多方面机制来实现的。Hou X等[26]通过动物实验从脑细胞凋亡角度探讨了同时针刺百会穴与大椎穴对于海洛因复吸的影响，结果表明：经过针刺干预后，所观察的海马和额叶区域病理损伤明显减轻，同时Bcl-2表达上调、Bax表达下调，可见针刺发挥了类似西药美沙酮的效果。由此得出结论，同时针刺百会穴与大椎穴可以预防海洛因复吸大鼠的脑细胞凋亡。李占标等[27]观察了针刺疗法对局灶性脑缺血大鼠大脑皮质蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）表达的影响，探讨了针刺疗法对局灶性脑缺血大鼠的神经保护机制。实验结果显示，针刺能够降低局灶性脑缺血大鼠缺血侧大脑皮质的细胞凋亡率，提高大脑皮质PKA阳性细胞表达率，促进神经修复与再生，从而降低神经性为缺损评分，改善受损神经功能。吴生兵等[28]研究并观察了电针对脑心综合征大鼠血肿周围脑组织细胞凋亡和caspase-3表达的影响情况。通过实验结果得出结论：电针能够有效地抑制脑心综合征大鼠血肿周围的脑细胞凋亡，其机制可能和下调病灶周围Caspase-3的表达相关。

郭晓红等[29]应用Annexin V/PI流式细胞分析法与TUNEL法2种方法对肝细胞的凋亡进行了对比性研究，发现：前者的特异性高，而后者的灵敏度高，因此将二者结合起来检测细胞凋亡更加准确。本实验TUNEL结果证明，脑出血后的急性期，血肿周围脑组织中凋亡细胞及其百分率显著增高，经增加针刺治疗后，虽较假手术后同时间开始干预的凋亡细胞及其百分率仍偏高，但与脑出血急性期同时间即单行捉抓干预比较仍有明显降低的趋势，且脑出血3 h开始结合针刺治疗的凋亡细胞及其百分率最低。流式细胞检测也再一次地验证了这个结果：结合针刺后，细胞凋亡率与脑出血急性期同时间即单行捉抓干预比较有降低明显，且脑出血3 h或9 h即开始配合针刺细胞凋亡率相对最低，疗效几近于假手术组。由此可见，该实验中TUNEL结果与流式细胞检测基本一致。提示针刺治疗能够改善脑出血急性期所造成的血肿周围脑组织相关的凋亡情况，从而在脑出血急性期起到保护脑组织的作用，且脑出血发生后针刺干预越早疗效越好。

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