羚羊角塞特异性PCR鉴别方法研究

蒋超 金艳 袁媛 黄璐琦 赵玉洋

摘要 目的：为解决中药羚羊角塞与羚羊角相比因失去“通天眼”等传统鉴别特征而鉴别困难的问题，建立准确鉴别鉴定羚羊角塞的方法。方法：通过比对羚羊角塞基原动物赛加羚羊与其7种常见混伪品的细胞色素C氧化酶亚基I（Cytochrome coxidase I，COI）序列，根据差异位点设计出仅扩增赛加羚羊DNA的特异性鉴别引物。结果：进行PCR时，当退火温度为64 ℃，循环数为33个时，仅羚羊角塞正品扩增获得约300 bp大小的条带，混伪品无条带。结论：该方法可作为准确有效检测待检样品是否来源于赛加羚羊的方法，用于羚羊角类样品的DNA鉴别。

关键词 特异性PCR；分子鉴定；羚羊角塞；中药鉴定

Abstract Objective：To solve the problem of authentication difficulty of saigae tataricae cornu tampon due to loss of traditional identify features such as “Tongtianyan”，and to establish an accurate authentication method for saigae tataricae cornu tampon.Methods：Specific PCR primers for S.tatarica were designed based on cytochrome coxidase I （COI） sequences and the annealing temperature of PCR reaction conditions was optimized，which was performed to authenticate saigae tataricae cornu tampon and its 7 adulterants.Results：Only saigae tataricae cornu tampon could obtain a ～300 bp specific band in electrophoresis while the adulterants did not when the temperature was 64 ℃ and 33 cycle number.Conclusion：Specific PCR could accurately and effectively authenticate the biological origin of sample is S.tatarica or not.

Key Words Specific PCR； Molecular authentication； Saigae tataricae cornu tampon； TCM authentication

中图分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.003

中药羚羊角为牛科动物赛加羚羊（Saiga tatarica Linnaeus）的角，角根所具骨质结构称羚羊角塞。羚羊角及羚羊角塞均为我国传统名贵中药材，具有平肝息风、清肝明目、散血解毒的功效，临床效果显著。

近年来，由于羚羊角类药材（包括羚羊角、羚羊角塞、羚羊角镑片等）资源储量下降，导致常出现伪品混入及跨国走私等现象。羚羊角塞基原物种赛加羚羊主要分布于我国及一些中亚国家，但分布于我国新疆地區的赛加羚羊已因过度捕猎而灭绝，而分布于国外的种群也因盗猎等原因在短短几年内数量下降了90%，致使药用资源严重不足[1-2]。山羊（Capra hircus）、绵羊（Ovis aries）、普氏原羚（Procapra przewalskii）、藏原羚（Procapra picticaudata）、藏羚羊（Pantholops hodgsonii）、蒙原羚（Procapra gutturosa，黄羊）、鹅喉羚（Gazella subgutturosa，长尾黄羊）等动物的角常作为赛加羚羊角类的民间代用品[3]，但其疗效尤其是退热效果与正品羚羊角具有明显差异[4]，不可混用。然而，羚羊角类药材主要为蛋白质和骨质成分，缺乏用于作为标记区分的小分子次生代谢物，使用显微鉴别、薄层色谱、蛋白电泳等方法鉴定均有一定困难，大多数只能区分羚羊角和山羊角等少数几种角类，而羚羊角塞因仅剩骨质部分，已丢失羚羊角类传统鉴别特征“合把”和“通天眼”，性状鉴别更为困难。需要建立更加快速、准确的方法来鉴定羚羊角塞与其混伪品。

特异性PCR鉴别是一种根据物种品间差异序列设计特异性引物从而专一性鉴别是否为所要求生物基原的DNA分子检测方法。该技术因其客观、准确，可为中药材的鉴定提供准确的结果。2010年版《中华人民共和国药典》收载了使用特异性PCR技术鉴别动物类药材蕲蛇、乌梢蛇饮片的方法，成为世界上首个中药、天然药分子鉴定国家标准，其准确性得到了充分验证[5-6]。目前已有多种动、植物药材成功应用特异性PCR技术进行基原鉴定，其对保障药材市场药品安全、准确具有重要的作用[7-11]。虽然目前也有使用特异性PCR方法鉴别羚羊角类药材的报道，但多只针对山羊角、黄羊角等2～3个物种，并未囊括鹅喉羚、水牛角等最为常见的伪品[12-13]。本研究通过比对羚羊角塞基原动物赛加羚羊及其7种常见混伪品线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（Cytochrome Coxidase I，COI）基因片段序列，设计了一对仅扩增赛加羚羊DNA的特异性鉴别引物，通过使用试剂盒快速提取DNA，经优化特异性PCR反应程序进行快速扩增，能准确鉴别羚羊角塞及其混伪品，为实现羚羊角类药材的特异性DNA分子鉴别提供技术保障。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 PCR仪：ABI 9700（Life公司）、VeritiTM（Life公司）、TC-96（杭州博日公司）以及S1000型（Bio-Rad公司）；5810 R型高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；VORTEX-2 GENIE漩涡震荡仪（Scientific industries公司）；PowerPacTM型电泳仪（Bio-Rad公司）；HE99X-15-1.5型电泳槽（Hoefer公司）；SYNGENE凝胶成像系统（GENE公司）。

1.2 试剂 不同特性Taq DNA聚合酶：r Taq（Takara公司生产）、Trans Taq（TransGen公司生产）、Vazyme Taq plus（Vazyme公司生产），中度保真的Ex Taq（Takara公司生产）、HS Taq（Takara公司生产），高度保真的SpeedSTAR HS Taq聚合酶（Takara公司生产）进行试验；琼脂糖（Promega公司生产）；溴化乙啶（Fluka公司生产）；DL2000 DNA Marker（Takara公司生产）；10000×SYBR（Invitrogen公司生产）；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 分析样品 采集来自于不同产地的羚羊角塞正品及常见混伪品共52份材料进行特异性PCR鉴别研究。样品采自安徽亳州、广西玉林、河北安国等药材市场，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心。见表1。

2 方法与结果

2.1 引物设计

2.1.1 序列比对 从NCBI数据库（National Center for Biotechnology Information）中下载羚羊角塞的基原物种赛加羚羊（KF73209.1、KC679014.1、KC679010.1）及其可能的混伪品基原物种绵羊（KT750038.1）、山羊（JN245994.1）、普氏原羚（KC679051.1）、藏原羚（KC679009.1）、藏羚羊（HQ269460.1）、蒙原羚（KC679036.1）、鹅喉羚（KC679026.1）的COI序列经Clustal W程序进行多重序列比对，选择羚羊角塞基原动物与其混伪品序列差异大的区域进行引物设计。

2.1.2 引物设计 使用Premier Primer 5.0（http：//www.premierbiosoft.com/primerdesign/）设计特异性PCR鉴别引物，调整参数使引物为3′末端位于赛加羚羊与其混伪品序列差异区域，PCR产物长度为100～400 bp，Tm值为55～65 ℃。引物命名为LYJ.F和LYJ.R，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.2 基因组总DNA的提取 取2 g样品，用70%乙醇擦拭表明，使用Retsch MM 400球磨仪粉碎至能过80目筛，取50 mg粉末，使用Wizard SV Genomic DNA Purification System（Promega公司）试剂盒按说明书进行DNA提取。

2.3 PCR扩增条件的确定 通过调整PCR体系和反应程序确定蛤蚧特异性鉴别的最优条件。25 μL初始PCR反应体系在200 μL离心管中进行PCR反应。反应总体积为25 μL，包括10×PCR缓冲液2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L each）1.5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.4 μL和模板1 μL，加入羚羊角塞正反向鉴别引物（10 μmol/L）各0.2 μL，用无菌双蒸水补足反应体积。PCR反应在VeritiTM型PCR扩增仪上进行。初始反应程序。见表2。取PCR反应产物，加入5 μL 6×Loading buffer（Takara公司）混匀后于GelRed染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。

使用羚羊角塞鉴别引物对羚羊角正品及其常见伪品总DNA模板进行扩增，并分别考察：1）退火温度；2）PCR循环数；3）模板DNA浓度；4）变性和退火时间；5）Taq种类；6）不同PCR仪对PCR反应稳定性的影响。

2.4 羚羊角塞特异性鉴别引物的设计 使用ClustalW软件对赛加羚羊、山羊、绵羊、普氏原羚、藏原羚、藏羚羊、蒙原羚、鹅喉羚的COI序列进行多重序列比对，以赛加羚羊与混伪品具有差异的SNP位点为基础设计引物，赛加羚羊预期扩增长度为266 bp，如图1。

2.5 羚羊角塞特异性PCR鉴别条件考察 由于影响特异性鉴别准确性的关键因素包括退火温度、循环数和模板DNA浓度，而决定PCR反应速度的核心因素为循环数和退火/延伸时长，本研究以正品扩增强度和伪品条带有无为指标，依次对退火温度、循环数、DNA浓度、变性/退火时间进行了系统考察，同时考察筛选的条件对不同Taq DNA聚合酶及不同PCR扩增仪的耐受性，结果表明，退火温度位于60～66 ℃，循环数27～33，DNA模板浓度1～25 ng/μL羚羊角及其常见混伪品。见表3。在此条件下对不同保真度的Taq酶和不同型号PCR仪均具有耐受性。见表3。而退火温度过低（<60 ℃）、循环数过大（>33）则会产生假阳性结果，模板浓度过低（<1 ng/μL）则会产生假阴性结果。最终确定羚羊角特异性PCR鉴别反应条件为95 ℃预变性5 min，循环反应33次（95 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s）72 ℃延伸5 min。

2.6 适用性考察 使用羚羊角塞特异性鉴别引物，采用筛选出的扩增体系和PCR反应条件，对不同药材市场的31批羚羊角类样品（其中羚羊角塞20批，羚羊角11批）及混伪品21批进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，仅羚羊角和羚羊角塞正品在200～300 bp间产生明亮单一条带，伪品无条带。见图2、图3。不同来源的正品羚羊角塞均产生一致结果，表明该体系能稳定准确地鉴别羚羊角塞。

3 讨论

遗传间断是进行物种划分的基础，DNA分子鉴定的前提条件是正品与混伪品间存在序列差异，本研究对正品羚羊角塞的基原物种赛加羚羊及外观形态相似的7种混伪品物种COI序列进行了分析，发现正伪品序列存在显著差异，系统发育树分析亦呈单系[14-15]，故而可从根据COI序列差异位点设计特异性引物进行鉴别。

进行PCR分子鉴别的第一步是DNA提取，不同的方法其DNA提取效果可能会有区别，同时因羚羊角塞为骨制品，DNA提取较为困难。为保证鉴别结果的准确性，本研究试验了不同的DNA提取方法（Promega DNA提取试剂盒，柱式骨骼DNA提取试剂盒，SDS法和CTAB法），发现各方法均能获得良好的提取效果，光吸收比值A260/A280>1.5，浓度均>20 ng/μL，且均可满足PCR扩增的基本要求。本研究选择最为简便的Promega DNA提取试剂盒进行DNA提取。方法学考察是获得稳定、准确DNA分子鉴别方法的必要步骤[16]。我们对影响PCR扩增的核心因素，如退火溫度、PCR循环次数、DNA浓度、DNA聚合酶用量及不同品牌的PCR仪和DNA聚合酶进行了考察，发现所建立的特异性PCR鉴别方法具有很强的稳定性。见表3。为考察羚羊角塞特异性PCR鉴别方法的特异性和适用性，本研究收集了不同药材市场的31批羚羊角塞类正品和市场常见的21批羚羊角塞混伪品进行验证，结果仅正品能扩增获得约300 bp大小的条带，混伪品无条带，表明所建立的特异性PCR鉴别方法能专属性鉴别待检样品是否为正品基原，对羚羊角塞药材的使用和流通的安全性与规范性起到保障作用。

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