基于AutoBlendPlus技术的HPLC法同时测定抗感冒复方制剂中5种不同酸碱性成分的含量

李欣 顾王文 李金丰 张志文 孙考祥

中圖分类号 R927.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）20-2758-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.20.05

摘 要 目的：建立同时测定抗感冒复方制剂中5种不同酸碱性成分含量的方法。方法：采用高效液相色谱法，工作站为ACQUITY Arc系统的Auto·Blend Plus软件，色谱柱为Discovery? HS F5-5，流动相为酸混合液-碱混合液-甲醇-0.3%三乙胺（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为270 nm（对乙酰氨基酚、水杨酰胺、马来酸氯苯那敏、盐酸曲普利啶）、299 nm（乙酰水杨酸），柱温为35 ℃，进样量为20 μL。结果：对乙酰氨基酚、水杨酰胺、乙酰水杨酸、马来酸氯苯那敏、盐酸曲普利啶检测质量浓度线性范围分别为26～411 μg/mL（r=0.999 6）、16～254 μg/mL（r=0.999 8）、16～748 μg/mL（r=0.998 1）、35～565 μg/mL（r=0.999 8）、25～404 μg/mL（r=0.999 7）；定量限分别为3.6、3.1、4.0、9.6、6.3 μg/mL，检测限分别为1.9、1.3、1.4、2.9、2.3 μg/mL；中间精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2%；加样回收率分别为100.0%～102.0%（RSD=0.59%，n=9）、95.2%～101.0%（RSD=1.55%，n=9）、96.2%～99.9%（RSD=1.24%，n=9）、96.2%～101.5%（RSD=1.57%，n=9）、96.3%～98.9%（RSD=0.83%，n=9）；耐用性试验的RSD均小于3%。结论：该方法操作简便、准确，精密度、稳定性、重复性、耐用性好，可用于抗感冒复方制剂中5种不同酸碱性成分含量的同时测定。

关键词 Auto·Blend Plus技术；ACQUITY Arc系统；高效液相色谱法；对乙酰氨基酚；水杨酰胺；乙酰水杨酸；马来酸氯苯那敏；盐酸曲普利啶；含量测定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous contents determination of 5 kinds of acid and alkaline componentsin anti-cold compound preparation. METHODS： HPLC method was adopted. The workstation was Auto·Blend Plus software of ACQUITY Arc system. The determination was performed on Discovery? HS F5-5 column with mobile phase consisted of acid mixture-base mixture-methanol-0.3% triethylamine （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelengths were set at 270 nm （acetaminophen，salicylamide，chlorphenamine maleate，triprolidine hydrochloride） and 299 nm （aspirin）. The column temperature was 35 ℃，the sample size was 20 μL. RESULTS： The linear ranges of acetaminophen，salicylamide，acetylsalicylic acid，chlorphenamine maleate，triprolidine hydrochloride were 26-411 μg/mL（r=0.999 6）， 16-254 μg/mL（r=0.999 8）， 16-748 μg/mL（r=0.998 1）， 35-565 μg/mL（r=0.999 8） and 25-404 μg/mL（r=0.999 7），respectively. LOQ were 3.6， 3.1， 4.0， 9.6， 6.3 μg/mL； LOD were 1.9， 1.3， 1.4， 2.9， 2.3 μg/mL， respectively. RSDs of intermediate precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2%. Average recoveries were 100.0%-102.0%（RSD=0.59%，n=9）， 95.2%-101.0%（RSD=1.55%，n=9）， 96.2%-99.9%（RSD=1.24%，n=9）， 96.2%-101.5%（RSD=1.57%，n=9）， 96.3%-98.9%（RSD=0.83%，n=9）， respectively. RSDs of durability tests were lower than 3%. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate， precise， stable， reproducible and durable， and can be used for simultaneous contents determination of 5 kinds of acid and alkaline components in anti-cold compound preparation.

KEYWORDS Auto·Blend Plus method； ACQUITY Arc system； HPLC； Acetaminophen； Salicylamide； Acetylsalicylic acid； Chlorphenamine maleate； Triprolidine hydrochloride； Content determination

高效液相色谱法（HPLC）是针对一个或一批样品建立的一整套完整的色谱分析方法[1]。在试验过程中，分析人员需对一系列的色谱参数，如流动相类型、pH、缓冲液浓度以及流速、柱温、检测波长等条件，不断进行优化以筛选出最适用的条件[2-4]。当待测成分分离度依赖于流动相的pH时，需要配制系列pH缓冲液作为流动相进行筛选，其过程复杂、操作烦琐。对乙酰氨基酚、水杨酰胺、乙酰水杨酸、马来酸氯苯那敏、盐酸曲普利啶都是常见的抗感冒复方制剂组成成分，其酸碱性不同，当同时含有这样几种性质差异较大的成分时，很难采用相同的色谱条件将其分离并进行测定[5-6]。鉴于此，笔者应用美国Waters公司推出的Auto·Blend Plus技术，开发出同时测定抗感冒复方制剂中多种酸碱性成分的色谱分析方法，不需手动配制系列pH缓冲液，仅需设定好每个成分的适用pH，系统即可自动调节流动相[7]，从而可为建立实验室快速分析方法提供一定借鉴。

1 材料

1.1 仪器

ACQUITY Arc系统、Auto·Blend Plus软件、e2695型HPLC仪（包括四元泵、光电二极管阵列检测器、自动进样器、Empower色谱工作站）均购自美国Waters公司；CP225D型十万分之一电子分析天平、QUINTIX224-1CN型万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）；Micro 17R型台式冷冻离心机（美国Thermo公司）；Milli-Q型纯水仪（美国Millipore公司）；DL-480A型超声波清洗仪（上海之信仪器有限公司）；ACD Labs 12.0软件（加拿大Advanced Chemistry Development，Inc.）。

1.2 试剂

对乙酰氨基酚对照品（批号：A1125AS，纯度：>99%）、水杨酰胺对照品（批号：S1101AS，纯度：>98%）、乙酰水杨酸对照品（批号：O0312AS，纯度：>99%）、马来酸氯苯那敏对照品（批号：A0703AS，纯度：>98%）均购自上海赛抑生物科技有限公司；盐酸曲普利啶对照品（中国食品药品检定研究院，批号：101063- 201001，纯度：94.2%）；甲醇、三乙胺为色谱纯，马来酸、柠檬酸、琥珀酸酸、4-甲基吗啡啉、吗啡啉、氢氧化铵、哌啶为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

工作站：ACQUITY Arc系统的Auto·Blend Plus软件；色谱柱：Discovery? HS F5-5（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：酸混合液（马来酸、柠檬酸、琥珀酸浓度分别为50、25、25 mmol/L）（A）-碱混合液（4-甲基吗啡啉、吗啡啉、氢氧化铵、哌啶浓度均为50 mmol/L）（B）-甲醇（C）-0.3%三乙胺（D），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm（对乙酰氨基酚、水杨酰胺、马来酸氯苯那敏、盐酸曲普利啶），299 nm（乙酰水杨酸）；柱温：35 ℃；进样量：20 ?L。

2.2 样品与溶液的制备

2.2.1 样品 参照已上市药品氨酚曲麻片、复方氨酚烷胺片、阿司匹林片的处方，取对乙酰氨基酚对照品0.1 g、水杨酰胺对照品0.05 g、乙酰水杨酸对照品0.1 g、马来酸氯苯那敏对照品2 mg、盐酸曲普利啶对照品1.2 mg，辅料为淀粉、乳糖、微晶纤维素、低取代羟丙纤维素和硬脂酸镁，采用粉末直压工艺得到同时包含5种待测成分的样品，平均片质量为1.2 g，载药量为21%。

2.2.2 混合对照品溶液 分别取对乙酰氨基酚对照品、水杨酰胺对照品、乙酰水杨酸对照品、马来酸氯苯那敏对照品、盐酸曲普利啶对照品17.13、10.57、31.17、23.55、16.85 mg，精密称定，置于20 mL量瓶中，加70%甲醇超声（功率：480 W，频率：40 kHz，下同）溶解并定容，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液 取样品适量，研细，精密称取0.6 g，置于20 mL量瓶中，加70%甲醇溶液超声溶解并定容，摇匀，12 000 r/min离心10 min，取上清液，即得。

2.2.4 阴性对照溶液 按样品处方和工艺制备缺对乙酰氨基酚、水杨酰胺、乙酰水杨酸、马来酸氯苯那敏、盐酸曲普利啶的阴性样品，并按“2.2.3”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。结果，理论板数按对乙酰氨基酚、水杨酰胺、乙酰水杨酸、氯苯那敏、曲普利啶峰计均大于6 000；基线分离良好，分离度均大于1.9。

2.4 专属性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。结果，阴性对照在与对乙酰氨基酚、水楊酰胺、乙酰水杨酸、氯苯那敏、曲普利啶峰保留时间相同处未见干扰峰，表明本方法专属性良好。

2.5 线性关系考察

分别精密量取“2.2.2”项下混合对照品溶液0.3、0.5、1.0、1.2、2.4、4.8 mL，置于10 mL量瓶中，加70%甲醇定容，摇匀，制成系列混合对照品溶液。精密量取上述系列混合对照品溶液各20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表2。

2.6 定量限与检测限考察

分别精密量取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分别计算定量限、检测限，结果见表2。

2.7 中间精密度试验

由2名分析员分别在不同日期精密称取样品适量，各6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件在不同仪器上进样测定，记录峰面积。结果，对乙酰氨基酚、水杨酰胺、乙酰水杨酸、氯苯那敏、曲普利啶峰面积的RSD分别为0.89%、0.65%、0.92%、0.32%、0.14%（n=12），表明本方法中间精密度良好。

2.8 稳定性试验

取“2.2.3”项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0、2、8、12、24、48 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，对乙酰氨基酚、水杨酰胺、乙酰水杨酸、氯苯那敏、曲普利啶峰面积的RSD分别为0.71%、0.26%、1.51%、0.62%、0.81%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置48 h内基本稳定。

2.9 重复性试验

精密称取同一批样品适量，共6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算标示量百分比。结果，对乙酰氨基酚、水杨酰胺、乙酰水杨酸、马来酸氯苯那敏、盐酸曲普利啶标示量百分比平均值分别为100.0%、99.8%、99.8%、100.0%、99.6%，RSD分别为0.02%、0.43%、0.02%、0.16%、0.28%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验

按“2.2.2”项下方法制备混合溶液，共9份，分别加入0.4、0.5、0.6 mL的混合对照品溶液适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液[8]，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

2.11 耐用性试验

2.11.1 色谱柱考察 精密称取样品适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件[分别设置色谱柱为Discovery? HS F5-5（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Ultimate? XB-Phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm]进样测定，记录峰面积并计算标示量百分比，结果见表4。结果表明，当色谱柱发生一定程度变化时，本方法能满足试验要求，耐用性良好。

2.11.2 流速考察 精密称取样品适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件（分别设置流速为0.9、1.0、1.1 mL/min）进样测定，记录峰面积并计算标示量百分比，结果见表4。结果表明，当流速发生一定程度变化时，本方法能满足试验要求，耐用性良好。

2.11.3 柱温考察 精密称取样品适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件（分别设置柱温为33、35、37 ℃）进样测定，记录峰面积并计算标示量百分比，结果见表4。结果表明，当柱温发生一定程度变化时，本方法能满足试验要求，耐用性良好。

2.12 样品标示量百分比测定

取样品适量，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并计算标示量百分比，结果见表5。

3 讨论

流动相pH的改变是分析过程中一个至关重要的环节，因为一些对pH敏感的成分，即使发生3/10 pH单位的细微变化，也会极大地改变其洗脱时间[9]。Auto·Blend Plus技术最初用于蛋白质分离，本试验采用该技术优化对pH敏感化学成分的色谱分离，挑选出5种分别具有不同酸碱性的待测成分，在试验设计中选择梯度洗脱更有利于各成分的分离。从化学结构式来看，对乙酰氨基酚、水杨酰胺具有酰胺键，马来酸氯苯那敏和盐酸曲普利啶成盐，均比较稳定。乙酰水杨酸有一个酯键，有文献报导其水溶液不稳定，极易水解生成水杨酸[10]。笔者比较了流动相pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5时5种待测成分的分离情况。结果显示，当pH<4時，各色谱峰峰形均较好，但在该条件下无法将马来酸氯苯那敏与盐酸曲普利啶完全分开。当pH≥5时，乙酰水杨酸色谱峰发生改变，峰形变宽且拖尾严重。经验证，该色谱峰为乙酰水杨酸的水解产物水杨酸，而有文献报道酸性体系可有效抑制乙酰水杨酸水解[11]。当pH≥5.5时，马来酸氯苯那敏与盐酸曲普利啶可得到较好分离，且pH越大两者分离效果越好，但保留时间也会随之延长。在试验过程中发现，马来酸氯苯那敏和盐酸曲普利啶有严重的峰拖尾现象，而后期优化过程中通过加入0.3%三乙胺能明显改善峰拖尾现象。

整个试验过程中采用全波长扫描，在后期采用分段波长处理[12]。由于乙酰水杨酸在299 nm波长处有最大吸收，在270 nm波长处吸收很弱，而其余4个成分在270 nm波长处吸收较好，因此乙酰水杨酸的出峰时间段采用299 nm波长进行扫描（13.1～13.5 min），其他成分的出峰时间段采用270 nm波长进行扫描。

本试验建立了一种可以同时测定酸碱性不同的多成分的方法。在一个流动相体系中可以设置两个pH值，简化了配制不同pH流动相的过程，达到快速、简便、准确的效果。在整个方法操作过程中，只需配制两次流动相（A相和B相的贮备溶液），通过设置一个序列表即可实现连续进样，从而快速完成各个组分的分离鉴定。与采用pH/溶剂双梯度反相HPLC法[13]以及微乳液相色谱法[14]同时测定一种抗感冒复方制剂中多种组分的含量相比，极大地减少了方法摸索过程中的工作量。与文献[15]报道的采用普通溶剂梯度法测定阿酚咖敏片中对乙酰氨基酚、乙酰水杨酸和马来酸氯苯那敏的含量相比，本试验方法检测时间缩短了近40 min。综上所述，本方法可同时分离酸性、碱性化学成分，有效简化了工作流程，适用于同时测定抗感冒复方制剂中多种酸碱性不同的成分的含量。

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（收稿日期：2017-12-18 修回日期：2018-02-06）

（编辑：张 静）