葛根水煎剂和配方颗粒HPLC指纹图谱

张肖建 霍保军 李军山 姜国志 刘铁军 李振江

摘要：为了能全面准确地反映葛根配方颗粒和水煎剂成分的一致性和葛根配方顆粒替代传统饮片的可行性，对葛根配方颗粒和水煎剂的特征图谱进行了相关性研究。采用华谱 XAqua C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以甲醇-0.1%冰醋酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，检测波长为250 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为25 ℃，采集时间为41 min，分别建立10批葛根水煎剂和10 批葛根配方颗粒的特征图谱。结果表明，10批葛根配方颗粒HPLC 特征图谱的8个特征峰均可在水煎剂中得到追踪，相似度均大于0.99，并从8个共有峰中指认出葛根素。葛根水煎剂和配方颗粒的主要化学成分基本相同，且共有成分含量比例相近，为中药配方颗粒替代传统饮片的可行性以及临床研究提供了重要依据。

关键词：医药工程；葛根；水煎剂；配方颗粒；HPLC；指纹图谱

中图分类号：R917文献标志码：Adoi： 10.7535/hbgykj.2018yx03013

葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根，习称野根，具有解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络、解酒毒之功效，临床用于治疗泄泻等病症[1-4]。现代研究表明，葛根的主要活性成分为葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类化合物，其中葛根素含量最高，大豆苷及大豆苷元含量很低[5]，因此葛根素是评价葛根药材及其制剂质量的重要指标[6-9]。

第3期张肖建，等：葛根水煎剂和配方颗粒HPLC指纹图谱相关性研究河北工业科技第35卷配方颗粒具有携带服用方便、疗效确切、起效迅速等优点，受到诸多医院及药店的青睐。葛根配方颗粒是以水为提取溶媒，用其饮片作为原料，经过2次提取（与传统汤剂的煎煮相似，煎煮2次）、药液浓缩、使用喷雾干燥技术（喷雾干燥是药液通过雾化器雾化后与热空气接触，瞬间将水分汽化蒸发除去而形成干粉）、干法制粒（通过挤压将粉末压成所需硬度的薄片，破碎后过筛得到合格颗粒的方法）等工序加工而成。这些工序中提取浓缩过程与传统汤剂煎煮相似，喷雾干燥过程中因只是瞬间的高温，因而对产品的影响较小，干法制粒对产品成分更无影响，且葛根素热稳定性较好，因此葛根配方颗粒与传统汤剂理论上具有一致性。葛根饮片经加工制成配方颗粒后，仅依据《中华人民共和国药典》对其指标成分进行含量测定是难以全面客观地进行评价的。以往的研究只是单独针对葛根药材或饮片或者其制剂，未能研究所制备的产品在其各成分上与传统汤剂的关联性。为了能更全面准确地反映传统汤剂与配方颗粒之间的关联性，本研究采用高效液相色谱法，分别建立葛根配方颗粒和葛根水煎剂的特征图谱，比较二者之间的差异，为临床应用提供有力的数据支撑。

1主要仪器与材料

Agilent高效液相色谱仪，AE 240 电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 有限公司提供）。

葛根素对照品，批号为110752-201313，购自中国食品药品检定研究院；10批葛根饮片来源见表1（编号为A1—A10），均经河北省食品药品检验所孙宝惠老师鉴定为豆科植物野葛Pueraria lobata （Willd.） Ohwi的干燥根；由编号为A1—A10葛根饮片制备的10 批葛根配方颗粒（编号为B1—B10）批号见表2；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2实验方法

2.1溶液制备

2.1.1对照品溶液的配制

取葛根素对照品适量，精确称定，加甲醇制成1 mL含葛根素0.25 mg的溶液，即得对照品溶液。

2.1.2葛根配方颗粒供试品的制备

取葛根配方颗粒10批，研细，精确称取0.1 g，置于带塞的锥形瓶中，精确加入甲醇50 mL，称重，超声（频率40 kHz，功率300 W）处理30 min，放冷，再称重，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，即得。

2.1.3葛根水煎剂供试品溶液制备

取10批葛根饮片100 g，一煎加入9倍水浸泡30 min煎煮20 min，二煎加入7倍水煎煮15 min。将提取液过滤浓缩干燥为膏粉，精密称取01 g，置于带塞的锥形瓶中，精确加入甲醇50 mL，称重，超声30 min，放冷，再称重，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2.1.4阴性对照溶液的制备

精确称取糊精0.1 g，置于带塞的锥形瓶中，精确加入甲醇50 mL，称重，超声（频率40 kHz，功率300 W）处理30 min，放冷，再称重，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，即得。

2.2色谱条件[8-9]

色谱柱：华谱 XAqua C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相：以甲醇（A）和0.1%（体积分数，下同）的冰醋酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱条件见表3，流速为1.0 mL/min，检测波长为250 nm，柱温为25 ℃。

表3梯度洗脱条件

Tab.3Elution conditions

时间/min流动相A

φ（甲醇）/%流动相B

φ（0.1%冰醋酸水溶液）/%01387133858174258306832311387411387

2.3方法学考察[10-15]

2.3.1系统适用性及专属性试验

分别取配制的对照品、配方颗粒供试品、水煎剂供试品和阴性样品进行检测，考察此方法的适用性及专属性。结果如图1所示。由图1可以看出，样品中各个峰分离情况及峰型都较好，并且阴性无干扰，表明该方法的专属性良好。

S1—阴性样品；S2—对照品；S3—水煎剂；S4—配方颗粒。

2.3.2精密度试验

按照2.1所述方法制备葛根配方颗粒供试品溶液，重复进样6次。结果发现，各主要特征峰的相對保留时间及相对峰面积的RSD值（n=6）为013%～0.96%，表明仪器的精密度良好。

2.3.3稳定性试验

按照2.1所述方法制备葛根配方颗粒供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10 h时进样检测。结果发现，各主要指纹峰相对保留时间及相对峰面积的RSD值（n=6）为0.41%～1.23%，表明供试品溶液在10 h以内稳定。

2.3.4重复性试验

按照2.1所述方法制备葛根配方颗粒供试品溶液6份，依法测定。结果发现，各主要指纹峰相对保留时间及相对峰面积的RSD值（n=6）为0.41%～1.15%，表明该方法的重复性良好。

3结果与讨论

3.1葛根水煎剂与配方颗粒指纹图谱测定

按照2.1所述方法制备对照品溶液、葛根配方颗粒、水煎剂及阴性供试品溶液，进样10 μL，以22所述的色谱条件进行测定，记录41 min以内的色谱图。参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》建立HPLC指纹图谱，结果如图2、图3所示。可以看出，葛根水煎剂与配方颗粒的成分基本一致。

3.2参照峰的选择与共有指纹峰的标定

设定积分参数如下：斜率灵敏度为5，峰宽为002，积分起止时间8～41 min，最小峰的峰面积占总峰面积的比例大于1%。通过对比葛根配方颗粒和水煎剂的指纹图谱，选定共有的8个指纹峰作为共有峰。采用2008版指纹图谱相似度评价系统软件进行自动匹配，共有峰面积均大于色谱峰总面积的90%。通过与对照品图谱比较可知，在指纹图谱的8个共有峰中，峰3为葛根素。结果如表4所示。

3.3葛根指纹图谱相似度计算

采用2008版指纹图谱相似度评价系统软件计算相似度，计算时以对照图谱为参照，计算各批产品的指纹图谱与对照图谱的相似度。结果见表5。10批配方颗粒和葛根水煎剂的相似度分别为0.994～0.999和0.984～0.998，表明葛根水煎剂及配方颗粒的质量控制较为稳定。所标定的葛根配方颗粒8个共有指纹峰均可在水煎剂指纹图谱中得到追踪，表明葛根配方颗粒与水煎剂在化学成分上具有一致性，为中药配方颗粒替代传统饮片的可行性以及临床研究提供了重要依据。本研究所建立的指纹图谱方法重复性、稳定性好，可用于生产过程的质量控制。

4结语

本研究比较了甲醇-0.03%冰醋酸水溶液、甲醇-0.1%冰醋酸水溶液、甲醇-0.2%冰醋酸水溶液3种流动相的梯度洗脱效果。结果表明，以甲醇-0.1%冰醋酸水溶液进行梯度洗脱，峰形及分离度都较好。全波长扫描显示，在250 nm处有吸收峰，色谱图色谱峰数量较多，且峰形及分离度均较好。柱温分别选用25，30，35 ℃进行进样分析，结果显示，25 ℃的峰形及分离度较好。分别选用甲醇、30%甲醇、95%乙醇、水对葛根配方颗粒进行超声提取，结果显示，甲醇提取效率最高，色谱峰数量较多且面积较大。

中药材体系复杂，通过HPLC法检测葛根不同极性成分，能更全面地反映葛根中的主要成分，准确反映传统汤剂与配方颗粒之间的关联性。本文共标示了葛根水煎剂、配方颗粒的8个主要特征峰，相似度均在0.98以上，说明葛根水煎剂、配方颗粒较稳定，且葛根水煎剂、葛根配方颗粒在化学成分上具有一致性，为配方颗粒临床替代传统饮片提供了数据支撑。

本次研究建立的葛根配方颗粒高效液相指纹图谱分析方法的重复性好，分析全面，方法简便，能比较全面地反映葛根配方颗粒的质量，可作为内控质量标准。

本次研究从葛根配方颗粒与传统汤剂各成分的关联性为出发点，说明了葛根配方颗粒与传统汤剂在成分上具有一致性，但单独的方剂与经典的方剂合煎其疗效是否有等效性，需要做进一步的研究。

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