油橄榄叶提取物对非酒精性脂肪肝小鼠TLR4—p38MAPK信号通路的干预作用

[摘要]探讨油橄榄叶提取物干预非酒精性脂肪肝（NAFLD）的作用机制。用高脂饮食9周建立小鼠NAFLD模型，造模第2周起用OLE（1 000 mg/kg）进行灌胃治疗8周，利用全自动生化分析仪测定血脂水平，放射免疫法检测炎症因子指标，定量PCR和酶联免疫吸附法（ELISA）检测肝组织中Toll样受体蛋白4（TLR4）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）的水平和蛋白活力。结果显示，与模型组比较，OLE干预后，血清甘油三酯（TG）、游离脂肪酸（FFA）浓度显著降低；肝脏肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1（IL-1β）、TLR4、p38MAPK水平和蛋白显著降低。OLE可通过调节TLR4-p38MAPK 信号通路，缓解肝脏脂肪变性和炎症因子反应，抑制NAFLD的进展。

[关键词]油橄榄叶提取物；非酒精性脂肪肝；信号通路；小鼠

[中图分类号]R 282.710.5[文献标志码]A[文章编号]1005-0310（2018）03-0059-05

Abstract： The mechanism of olive leaf extract in the intervention of non-alcoholic fatty liver （NAFLD） is explored. The mouse NAFLD model is established with a high-fat diet for 9 weeks. The OLE （1 000 mg/kg） was used for intragastric administration for 8 weeks from the second week of establishment. The level of blood lipids was measured by an automatic biochemical analyzer， and the inflammatory index was measured by radioimmunoassay. Quantitative PCR and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） were used to detect Toll-like receptor protein 4 （TLR4） and p38 mitogen-activated protein kinase （p38MAPK） levels and protein activity in liver tissue. The results show that compared with the model group， serum triglyceride （TG） and free fatty acid （FFA） concentrations were significantly reduced after OLE intervention； liver tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1 （IL-1β）， TLR4， p38MAPK levels and protein were significantly reduced. OLE can alleviate hepatic steatosis and inflammatory factor responses and inhibit the progression of NAFLD by regulating the TLR4-p38MAPK signaling pathway.

Keywords： Olive leaf extract； Nonalcoholic fatty； Signaling pathway； Mouse

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是遺传、环境、代谢应激相关性疾病，现已成为世界慢性肝病的重要病因，可直接导致失代偿期肝硬化、肝细胞癌和移植肝复发等，但确切发病机制目前仍不清楚[1-2]。多酚、黄酮及橄榄苦苷是油橄榄叶主要活性成分，课题组前期已证实油橄榄叶提取物在排铅、海洛因脱毒、预防糖尿病、抗衰老、减轻缺血再灌注损伤等方面表现出突出的效果[3-12]，具有调节肝脏抗氧化能力、改善非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠肝功能的作用[13]。为进一步阐明其作用机制，本研究拟以小鼠为实验对象，建立非酒精性脂肪肝动物模型，围绕“Toll 样受体蛋白4-p38 丝裂原活化蛋白激酶（TLR4-p38MAPK）”信号通路，观察油橄榄叶提取物（olive leaf extract，OLE）对NAFLD的影响，以揭示OLE防治NAFLD的作用机制。

1材料与方法

1.1材料

油橄榄叶提取物（陇南田园油橄榄科技开发有限公司）；TNF-α、IL-1β试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；TLR4、p38MAPK ELISA试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）；RNA抽提试剂盒、反转录试剂、定量PCR试剂（Taka Ra公司），PCR引物由上海涵悦生物科技有限公司设计，生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

BS-300型全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；酶联免疫检测仪（ELx800，美国BioTek公司）；高速台式冷冻离心机（Beckman美国TGL-16 M）等；7900 HT Sequence Detection System定量PCR仪（美国ABI）；核酸蛋白分析仪（美国贝克曼库尔特公司）。40只清洁级昆明小鼠购于兰州大学实验动物中心（许可证号：SCXK（甘）2009-0004），体质量18～20 g，雌雄各半。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立与给药

健康昆明小鼠40只，随机分为4组，即正常组、模型组、罗格列酮组和OLE组，每组10只。参照文献[14]，正常组普通饲料喂养，其他各组每天给高脂饲料（繁殖鼠料54.8%，18.9%猪油，1.3%胆固醇，0.3%胆盐，11.2%蔗糖，8.7%酪蛋白，1.8%预混料及3%麦芽糊精）喂養9周，从造模第2周起正常组和模型组灌胃0.1 mL/（10 g·d）生理盐水，OLE组灌胃OLE（1 000 mg/（kg·d））进行治疗，连续给药8周。

1.2.2血生化指标测定

各组实验动物均用乙醚麻醉，摘眼球采血以3 000 r/min离心10 min，分离血清，用全自动生化分析仪检测TG和FFA浓度。

1.2.3肝组织中TNF-α、IL-1β含量的检测

末次给药后，迅速取肝，洗净、冰浴匀浆，3 000 r/min离心15 min，取上清液，采用放射免疫法中的液相竞争法和平衡法测定肝组织中TNF-α、IL-1β的含量，具体方法按照检测试剂盒说明书操作。

1.2.4肝组织中TLR4、p38MAPK蛋白活力的测定

取100 mg湿肝，加入1 mL PBS缓冲液，冰浴中匀浆（10 000 r/min）20 s，重复2次，将匀浆液4 ℃（3 600 r/min）离心20 min，取上清液，ELISA试剂盒检测。

1.2.5PCR检测肝组织中TLR4、p38MAPK mRNA 的表达

取小鼠肝脏，放入2 mL 的离心管，加入1 mL Trizol后用匀浆器反复研磨，离心（14 000 r/min）10 min，取上清液通过酚-氯仿抽提RNA，将抽提的RNA 进行逆转录反应，实时荧光PCR扩增。PCR按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.6数据处理

所有数据以±s表示，用SPSS13.0软件进行单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1OLE对NAFLD小鼠血清中TG、FFA浓度的影响

由图1可知，模型组小鼠的血清TG、FFA浓度较正常组均显著升高（P<0.01）；OLE组和罗格列酮组小鼠血清TG、FFA 浓度较模型组显著降低（P<0.01）；OLE组小鼠血清TG、FFA浓度显著低于罗格列酮组（P<0.05，P<0.01）。

2.2OLE对NAFLD小鼠肝组织中TNF-α、IL-1β质量浓度的影响

由图2可知，模型组小鼠的肝组织中TNF-α、IL-1β的质量浓度较正常组均显著升高（P<0.01）；OLE组和罗格列酮组小鼠肝组织中TNF-α、IL-1β的质量浓度较模型组显著降低（P<0.01）；OLE组小鼠肝组织中TNF-α、IL-1β的质量浓度显著低于罗格列酮组（P<0.05，P<0.01）。

2.3OLE对NAFLD 小鼠肝组织中p38MAPK mRNA表达的影响

由图3可知，模型组小鼠肝组织中TLR4、p38MAPK mRNA的表达量较正常组显著升高（P<0.01）；OLE组和罗格列酮组小鼠肝组织中TLR4、p38MAPK mRNA的表达量较模型组显著降低（P<0.01）；OLE组小鼠肝组织中TLR4、p38MAPK mRNA的表达量显著低于罗格列酮组（P<0.05，P<0.01）。

2.4OLE对NAFLD 小鼠肝组织中TLR4、p38MAPK 蛋白活力的影响

由图4可知，模型组小鼠肝组织中TLR4、p38MAPK的蛋白活力较正常组显著升高（P<0.01）；OLE组和罗格列酮组小鼠肝组织中TLR4、p38MAPK的蛋白活力较模型组显著降低（P<0.01）；OLE组小鼠肝组织中TLR4、p38MAPK 的蛋白活力显著低于罗格列酮组（P<0.01）。

3讨论

中药具有活性成分多、作用靶点多、给药途径多、不良反应小等特点，显示出良好的临床疗效和安全性。油橄榄叶主要活性成分是多酚、黄酮及橄榄苦苷，既往已证实油橄榄叶提取物具有良好的防治NAFLD的药效学效应[13]。TG、FFA含量是国内外应用较为广泛的衡量肝功能的重要指标，也是反映脂肪肝的重要指标[15]。本研究结果表明，OLE对模型组小鼠显著升高的TG、FFA含量具有高强度的抑制效应。

NAFLD 发病涉及TLR4-P38MAPK 信号通路异常[16]，TLR4-P38MAPK通路是介导炎症发生的主要信号转导通路之一[17]。TLR4是 p38MAPK 上游分子，属于toll样受体家族成员，是介导天然免疫和获得性免疫的跨膜蛋白，可通过识别相关配体活化信号通路中的下游转录因子，调控下游蛋白激酶，促使效应细胞表达、合成并释放大量的炎症因子，从而引发肝损伤[18-19]。本实验结果显示，模型组小鼠肝组织中TNF-α、IL-1β的质量浓度，TLR4、P38MAPK的基因表达水平及蛋白活力均明显升高，经OLE干预后，肝组织中TNF-α、IL-1β质量浓度，TLR4、P38MAPK的表达水平均呈下降趋势，表明OLE 对其有下调作用。研究表明，阻断TLR4-p38MAPK信号通路能减轻炎症反应，提示TLR4-p38MAPK 信号通路可能是OLE发挥抗炎和改善脂质代谢紊乱作用靶点。

综上所述，OLE可通过调节TLR4-p38MAPK 信号通路，缓解肝脏脂肪变性和炎症因子反应，抑制NAFLD的进展。该实验为研发OLE制剂防治肝损伤相关疾病提供了理论与实验依据，但有关其药理作用机制和量效关系等尚需进一步研究。

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（责任编辑李亚青）