窄叶鲜卑花提取物的抗氧化活性研究

2018-09-10陈叶马银山罗光宏焦杨

北京联合大学学报 2018年3期

陈叶马银山罗光宏焦杨

[摘要]目的：以绿茶为对照，研究了窄叶鲜卑花果穗和叶粗提取物的抗氧化活性及还原能力。方法：采用DPPH、ABTS自由基清除活性和Fe3+还原法对其抗氧化活性进行研究。结果：窄叶鲜卑花果穗中多糖、多酚、黄酮的提取率分别是40.3%、45.2%和21.7%，叶中提取率分别是52.3%、64.7%和29.8%，且叶提取物的多糖、多酚、黄酮含量均高于果穗。绿茶提取物中黄酮和多酚对清除DPPH、ABTS自由基起主要作用，而黄酮、多糖在果穗提取物清除DPPH自由基和叶提取物清除ABTS自由基时起主要作用；窄叶鲜卑花中脂类物质质量浓度小于0.4 mg/mL时，对DPPH、ABTS自由基清除效果较好。果穗和叶提取物的还原能力差异较小，且两者中多酚的还原能力随浓度呈较好的量效关系，而多糖和黄酮的还原能力随浓度增加其增幅不大，说明果穗和叶中具有还原能力的物质主要是多酚。结论：窄叶鲜卑花果穗和叶具有一定的抗氧化能力，且叶优于果穗。

[关键词]窄叶鲜卑花；提取物；自由基清除率；抗氧化

[中图分类号]Q 945[文献标志码]A[文章编号]1005-0310（2018）03-0052-07

Abstract： Objective：To study the antioxidative activity and reducing ability of crude extracts from the ear and leaf of Sibiraea Augustata， using green tea as a control. Method：The antioxidant activity is studied using DPPH， ABTS free radical scavenging activity and Fe3+ reduction method. Results：The extraction rate of polysaccharides， polyphenols and flavone are 40.3%， 45.2% and 21.7% from ear， and 52.3%， 64.7% and 29.8% from leaf. Further， the extracts of the leaf were higher than that of the ear from Sibiraea Angustata. Polyphenol and flavone of Green Tea play a major role in eliminating the free radicals of DPPH and ABTS， while flavone and polysaccharides from ear of Sibiraea Angustata play a major role in scavenging DPPH free radicals and extracting ABTS free radicals from leaf extracts. When the concentration of lipids is less than 0.4mg/mL， the scavenging effect is better on DPPH and ABTS free radical. The reduction ability of the extracts of the ear and leaf was small， and the reducing ability of the polyphenols in the two shows a good dose-effect relationship with the concentration， while the reducing ability of the polysaccharides and flavonoids increased slightly with increasing concentrations， indicating that the polyphenols in the ear and leaf are the main substances that have the reducing power. Conclusion：The leaf and ear of Sibiraea Angustata have certain antioxidant capacity， and the leaf is better than the ear.

Keywords： Sibiraea Angustata； Extract； Antioxidant activity； Antioxidant

窄葉鲜卑花（sibiraea angustata （Rehd.）Hand.Mazz.）俗名柳茶，为蔷薇科灌木，主要生长在海拔3 000～4 000米的阴坡灌木丛中或山谷砂石滩上[1]。其果穗和叶有健脾胃、治疗消化不良及胃病等功效[2]，是藏族民间常用药物[3]。藏区将窄叶鲜卑花作为茶用，无毒性报道[4]。现代药理研究表明，窄叶鲜卑花具有抗氧化[5-6]、调节脂质代谢、降脂减肥[7]、促消化[8]及提高机体特异性免疫[9]等功效。窄叶鲜卑花的果穗和叶中除含有有机酸类、三萜类、单萜、饱和脂肪醇类、多糖类、挥发油类及各种矿质元素[5]外，还含有皂苷、多酚、黄酮等功能活性成分，这些活性成分对清除人体产生的自由基、延缓细胞衰老的速度、提高人体的免疫力、减缓病害的发生等具有重要的作用。本实验以窄叶鲜卑花为原料，对其果穗和叶的提取物多糖、多酚、黄酮和脂肪进行了定量分析，同时研究了提取物在清除DPPH、ABTS自由基时，多糖、多酚、黄酮所起的抗氧化作用，以期为窄叶鲜卑花的开发及茶产品的研制提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

窄叶鲜卑花，于2017年8月下旬采自山丹县焉支山，采后自然阴干、研磨、低温储藏备用。绿茶由安徽省天旭茶业有限公司生产。邻苯二氮菲、双氧水、盐酸、邻苯三酚、FeSO4、乙醇、丙醛、甲醇、氯仿、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、没食子酸、FeCl3、铁氰化钾均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

TGL-16C台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱（上海玺袁科学仪器有限公司）、BT125D分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）、723PC可见光光度计（上海现科分光仪器有限公司）、RE-2000

A旋转蒸发器（巩义市京华仪器有限责任公司）。

1.3方法

1.3.1窄叶鲜卑花测定液的制备

称取研磨的窄叶鲜卑花果穗和叶各6.013 0 g、6.012 2 g，以料液比为1∶20在30 ℃、400 W超声提取3次，将3次所得滤液合并，浓缩。以绿茶叶为对照，称取6.036 2 g，制备方法同上。将上述3种浓缩液避光储存，用于抗氧化的测定。

称取果穗和叶各0.187 8 g、0.114 6 g，料液比为1∶40，叶用70%的乙醇，果穗用40%的乙醇，在40 ℃、400 W超声波提取40 min，在2 800 r/min下离心8 min，取上清液，低温、避光贮藏，用于多酚、黄酮的测定。

称取果穗和叶各0.103 5 g、0.107 2 g，在相同条件下用水提取，离心，得上清液，取上清液1 mL，按体积比为1∶3加入3 mL 95%乙醇，沉淀过夜，收集沉淀，用水溶解，用于多糖的测定。

1.3.2窄叶鲜卑花总脂的提取

分别称取果穗0.531 6 g、叶0.516 0 g，于具塞玻璃瓶中，分别加入甲醇-氯仿混合液（1∶1）40 mL，在40 ℃、400 W超声波提取40 min，将提取液倒入坩埚中，35 ℃蒸干并称重[10]。

1.3.3粗多糖含量的测定

采用苯酚-浓硫酸法，以标准曲线回归方程y=1.684 9x+0.036 6，R2=0.979 2（y为吸光度值，x为质量浓度mg/mL），测定多糖含量[11]。

1.3.4多酚含量的测定

采用福林-肖卡（Folin-Ciocalteu）比色法，以标准曲线回归方程y=0.013 9x+0.005 43，R2=

0.999 72（y为吸光度，x为质量浓度μg/mL），测定多酚的含量[11]。

1.3.5黄酮含量的测定

以芦丁作标准，用硝酸铝-亚硝酸钠比色法，以标准曲线回归方程y=1.172 1x-0.003 25，R2=0.994 7（y为吸光度值，x为质量浓度mg/mL），测定黄酮的含量[11]。

1.3.6DPPH自由基清除率

在试管中加入1 mL提取物，再加入2 mL 0.003% DPPH溶液，振荡后室温下避光放置30 min，测定517 nm波长的吸光度，以相应体积的无水乙醇代替蒸馏水，用于测定窄叶鲜卑花总脂对DPPH自由基的清除作用。计算清除率[11]。

清除率（%）=（A0-AS+AC）/A0×100%。

式中：A0为1 mL水+2 mL DPPH溶液的吸光度；A

S为1 mL样品溶液+2 mL的DPPH溶液的吸光度；A

C为1 mL待测溶液+2 mL 95%乙醇的吸光度（517 nm处样品本身的吸光度），空白为蒸馏水。

1.3.7ABTS自由基清除率

在试管中加入1 mL窄叶鲜卑花提取物，再加入2 mL ABTS工作液振荡后，避光静置6 min，测定734 nm波长处的吸光度值，空白为无水乙醇，计算清除率。计算公式同上。

1.3.8還原力的测定

在试管中加入2 mL窄叶鲜卑花提取物，再加入2 mL磷酸缓冲液，混匀加2 mL铁氰化钾，50 ℃水浴20 min后，冷却至室温，加2 mL的三氯乙酸振荡，然后取上清液2 mL，加入2 mL水，再加入0.4 mL FeCl3溶液，混匀反应10 min，在波长700 nm比色测定[11]。

清除率（%）=（A0-AS+AC）/A0 ×100%。

式中：A0为2 mL水+2 mL磷酸缓冲液+2 mL铁氰化钾+2 mL三氯乙酸+2 mL水+ 0.4 mL FeCl3；AS为2 mL样液+2 mL磷酸缓冲液+2 mL铁氰化钾+2 mL三氯乙酸+2 mL水+0.4 mL FeCl3；Ac为2 mL样液+2 mL磷酸缓冲液+2 mL水，空白为蒸馏水。

2结果与分析

2.1窄叶鲜卑花与提取物中多糖、多酚、黄酮的质量分数窄叶鲜卑花果穗和叶提取物中多糖、多酚、黄酮的质量分数见表1。

由表1测定结果可知，果穗和叶样品中多糖质量分数比对照组绿茶分别高33.65 mg/g和60.82 mg/g；果穗样品中多酚质量分数比对照组绿茶低22.74 mg/g，而叶样品中多酚质量分数比对照组绿茶高9.09 mg/g。果穗和叶样品中黄酮质量分数比对照组绿茶分别高70.26 mg/g和141.57 mg/g。果穗与叶比较，叶的多糖、多酚、黄酮均高于果穗，且叶中多糖、多酚和黄酮的提取率均高于果穗。

2.2窄叶鲜卑花中脂类物质的质量分数

果穗中脂类质量分数为0.18 mg/g，叶中脂类质量分数为0.41 mg/g，叶中脂类高于果穗，原因可能是与叶中含有大量脂溶性色素物质有关。

2.3提取物对自由基的清除率

2.3.1基于多糖质量浓度的提取物对DPPH、ABTS自由基的清除能力

由图1a）显示，果穗和叶对DPPH自由基清除能力均表现为量效关系，且果穗的清除趋势上升快，而叶的清除能力上升趋势较平缓，而对照组绿茶呈先急升后平缓。当多糖质量浓度为0.49 mg/mL時，叶对DPPH自由基的清除率达到84.2%，果穗清除率为83.5%。因此，多糖对果穗和叶中的DPPH自由基清除率较高。由图1b）可知，当多糖质量浓度小于0.05 mg/mL时，随多糖质量浓度的增大，系统内清除ABTS自由基能力逐渐增强。在质量浓度高于0.05 mg/mL后，随着多糖质量浓度的增加，果穗和绿茶清除能力趋势平缓，而叶清除ABTS自由基能力缓慢上升，明显高于果穗和绿茶。当多糖质量浓度达到0.29 mg/mL时，叶清除率为98.36%，高于同质量浓度下的果穗（95.86%）。

2.3.2基于多酚质量浓度的提取物对DPPH、ABTS自由基的清除能力

由图2a）可知，在多酚质量浓度为0～0.3 mg/mL范围内，果穗、叶和绿茶清除DPPH自由基能力明显呈上升趋势。当多酚质量浓度为1.05 mg/mL时，叶和对照

组绿茶的清除率分别为84.96 %和85.16 %，均高于果穗。说明多酚在叶和绿茶中清除DPPH自由基时起主要作用。由图2b）可见，在多酚质量浓度小于0.052 mg/mL范围内，3种反应体系清除ABTS自由基能力较大。当质量浓度在0.105 mg/mL之后，随着多酚质量浓度的增加，果穗和叶清除ABTS自由基能力趋于平缓，绿茶清除率呈缓慢增长趋势，且多酚质量浓度为0.65 mg/mL时，对照系统内ABTS清除率高达98.94%，说明多酚在绿茶清除ABTS自由基时起主要作用。而同质量浓度下果穗和叶的清除率明显弱于对照组绿茶。

2.3.3基于黄酮质量浓度的提取物对DPPH、ABTS自由基的清除能力

由图3a）可知，随着黄酮质量浓度的增大，反应系统清除DPPH自由基能力的趋势呈上升趋势。当黄酮质量浓度达到0.611 mg/mL时，叶的清除率达到85.57 %，果穗为83.93%，而对照组绿茶低于果穗和叶。由图3b）可见，在黄酮质量浓度小于0.031 mg/mL时，清除ABTS自由基趋势变化较大，之后质量浓度与清除率之间接近线性关系，但上升趋缓，且果穗和叶的清除率均高于对照。由此可知，在果穗、叶和绿茶提取物中，黄酮对清除DPPH、ABTS自由基都起主要作用。

2.3.4基于多糖、多酚、黄酮质量浓度的提取物还原能力的测定

不同质量浓度的多糖、多酚、黄酮液的还原能力测定见图4。由图4a）可见，随着提取物多糖质量浓度的增加，对照组绿茶线性更陡峭，而果穗和叶的趋势较平缓，表明多糖在果穗和叶中的还原力能力变化不大。由图4b）可知，多酚质量浓度与反应系统的还原能力呈量效齐升的线性关系，且对照组绿茶、果穗和叶的线性均陡峭，表明多酚在果穗、叶和绿茶中的还原力较强。由图4c）可见，随着黄酮质量浓度的增加，果穗和叶的变化趋势比较平缓，而对照组绿茶线性更陡峭。说明黄酮在对照组绿茶中的还原能力比果穗和叶更强。

2.4窄叶鲜卑花脂类物质清除DPPH、ABTS自由基的能力

由图5a）可见，窄叶鲜卑花总脂对DPPH自由基有明显的清除能力。当果穗和叶脂类物质质量浓度在0.2 mg/mL之前时，其清除率增长幅度较大，且果穗的清除率高于叶。当果穗和叶脂类物质质量浓度大于0.3 mg/mL时，叶清除DPPH自由基的能力大于果穗，且随着其质量浓度增大，二者清除DPPH自由基能力趋于平缓。当脂类质量浓度为1.6 mg/mL时，叶的清除率达到91.2%。由图5 b）可知，在质量浓度小于0.2 mg/mL范围内，脂类物质对ABTS自由基的清除幅度较大，当其质量浓度为0.2 mg/mL时，叶的清除率大于果穗。随着脂类质量浓度进一步增大，果穗和叶的清除趋势趋于平缓。当脂类物质质量浓度为1.6 mg/mL时，叶对ABTS自由基清除率达到最高（95.9%）。

3结束语

我国中草药资源丰富，含有多种抗氧化成分如多糖、多酚、黄酮等[12]。本实验以窄叶鲜卑花为材料，对提取物中多糖、多酚和黄酮进行了测定，结果表明，果穗中多糖、多酚提取率分别为44.62%和39.14%，而叶中分别为52.3%和64.7%；果穗和叶黄酮提取率为20%左右。叶提取物中多糖、多酚和黄酮质量分数分别为37.52 mg/g、45.95 mg/g、47.35 mg/g，而果穗中分别为17.96 mg/g、17.71 mg/g和19.01 mg/g；果穗和叶中多糖、黄酮含量远高于对照组绿茶，而多酚含量却明显低于对照组绿茶。叶中脂类物质质量分数高于果穗0.23 mg/g。

近年来国内外研究表明，大多数自由基和活性氧与心血管疾病的发生、发展有着密切关系，寻找抗氧化剂和抗氧化机理的研究尤为重要[12]。本研究表明，果穗提取物中多糖对清除DPPH自由基以及叶提取物中多糖对清除ABTS自由基起主要作用，而绿茶提取物中多酚对清除DPPH、ABTS自由基起主要作用；果穗、叶和绿茶提取物中黄酮对清除DPPH、ABTS自由基均起作用。窄叶鲜卑花脂类物质质量浓度小于0.4 mg/mL时，随着质量浓度的增大清除DPPH、ABTS自由基能力加大，当质量浓度大于0.4 mg/mL时，脂类物质对其清除趋势逐渐平缓。结果显示出果穗和叶具有良好的清除自由基和抗氧化能力。由此说明，不同材料，不同部位、不同浓度，主要清除DPPH、ABTS自由基的抗氧化物质不同，这与贾东升等在连翘上的研究和曾慧婷等在丹参上的研究一致。

窄叶鲜卑花果穗和叶中多酚的还原能力随质量浓度的增大而增大，多糖和黄酮在果穗和叶中的还原能力虽有增加，但二者增加幅度不大，而对照组绿茶中多糖、多酚和黄酮的还原能力均较大，说明窄叶鲜卑花果穗和叶中具有还原能力的物质主要是多酚。这可能是多酚含量与·OH清除活性和铁离子还原能力具有较高的相关性[13]。

本研究采用体外抗氧化体系对抗氧化活性进行了评定，但与机体内的抗氧化功效差异较大，因此，窄叶鲜卑花果穗和叶的药效价值尚需要进一步在以后实验中验证。

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