3种越橘桔茎尖初代培养与增殖研究

范世杰 杨忠华 尹文龙

摘要： 以红豆越橘、笃斯越桔和美登的茎尖为试材，对影响茎尖离体培养的取材时期、外植体的消毒、培养基和激素配比等因素进行研究的结果表明：休眠期水培促萌的嫩芽污染率较低，最利于茎尖诱导成活。适于灭菌的处理为：红豆越橘用75%酒精30 s+0.1%升汞2 min+次氯酸钠4 min;笃斯越桔和美登用75%酒精灭菌30 s+0.1%升汞灭菌处理4 min+次氯酸钠灭菌2 min。适于茎尖初代培养的培养基组合为：红豆越橘用WPM（改良）+6-BA 0.05 mg/L+IBA 0.5 mg/L+GA3 0.1 mg/L，诱导成苗率最高达84.42%;笃斯越桔、美登用WPM（改良）+6-BA 0.1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+GA3 0.1 mg/L，成苗率分别为83.44%、92.76%。适合的增殖培养基组合为：红豆越橘、笃斯越桔用WPM（改良）+ZT 1.0 mg/L+GA3为0.1 mg/L，增殖系数分别为3.90、3.72，苗高分别为2.66、2.51 cm;美登用WPM（改良）+ZT 1.2 mg/L+GA3 0.2 mg/L，增殖系数为4.59，苗高达到2.74 cm。

关键词： 红豆越橘; 笃斯越桔; 茎尖培养; 激素; 培养基; 增殖

中图分类号： S 722. 8， S 665. 9 文献标识码： A

组织培养以其培养周期短、繁殖系数高等优点成为了快速繁殖优良苗木的实用技术，目前已被广泛应用于农、林业等领域[ 1 - 4 ]。而茎尖培养技术是培育无病毒植株、种质资源保存、育种以及遗传转化等研究的有效手段[ 5 - 7 ]。 研究表明，影响植物微茎尖培养的因子主要有树种和品种[ 8 ]、取材及接种时期[ 9 ]、外植体的消毒[ 10 ]、培养基、激素[ 11 - 13 ]以及培养条件等。关于越橘、笃斯越桔以及蓝莓栽培种“美登”的组织培养已有大量报道[ 14 ]，以往主要是以叶片[ 15 ]、子叶、胚轴、腋芽和茎段[ 16 - 17 ]等为外植体，并建立了相应的组培快繁体系，而对茎尖组织培养缺乏系统的研究。因此，本研究以红豆越橘（Vaccinium vitis-idaea）、笃斯越桔（Vaccinium uliginosum）以及美登为试验材料，在不同生长期对其茎尖进行取材，对影响茎尖诱导的主要因子进行研究，旨在为3种越橘茎尖离体快繁、无病毒苗培育提供技术支撑。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

红豆越橘、笃斯越桔材料来源于大兴安岭漠河，美登材料来源于伊春。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 取材时期对茎尖诱导的影响

分以下几个时期进行取材：（处理1）取休眠期枝条于温室内水培催芽，灭菌后接种;（处理2）取新梢生长初期枝条的顶端新萌发嫩芽，灭菌后接种;（处理3）取新梢生长中期的顶端嫩枝茎尖，灭菌后接种;（处理4）取盛花期的枝条顶端茎尖，灭菌后接种;（处理5）取秋季休眠前的枝条顶端茎尖，灭菌后接种。

1. 2. 2 消毒剂和消毒时间对茎尖诱导的影响

取顶端嫩芽放入组培瓶中，滴2滴洗洁精，在自来水下冲洗30 min，然后在超净工作台上，用75%的乙醇溶液消毒30 s，再用无菌水冲洗2次，分別转到0.1%升汞、2%次氯酸钠溶液中灭菌处理2、4、6 min，然后用无菌水冲洗4～5次，最后用无菌滤纸吸干表面水分备用。

1. 2. 3 激素对茎尖诱导的影响

在解剖镜下剥取0.5 mm大小的茎尖迅速接种于改良的WPM（分别用708 mg/L的 Ca（NO3）2·4H2O、202 mg/L的KNO3代替 WPM 培养基中的 CaCl2和K2SO4）培养基上，培养基中分别添加0.05、0.1、0.5 mg/L的6-BA或ZT，添加0.1、0.5、1.0 mg/L的IBA，添加0.1 mg/L的GA3。每个处理接种30个茎尖，每个处理重复3次。蔗糖 20 g/L，琼脂 6 g/L，pH 值 5.4，培养温度均为（23± 2）℃ ，光照培养周期为 14 h/d，光照强度为 2 200 Lx，其他试验的条件均与此相同。

1. 2. 4 培养基对茎尖增殖的影响

分别以MS、WPM、WPM（改良）为基本培养基，培养基中分别添加1.0 mg/L的ZT和0.1 mg/L的GA3，将初代培养存活的茎尖接种到培养基上。

1. 2. 5 激素对茎尖增殖的影响

将初代培养存活的茎尖接种到WPM（改良）培养基上，培养基中分别添加0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mg/L的ZT，添加0.1 、0.2 mg/L的GA3。

1. 2. 6 数据统计分析

接种1周后统计污染率，45天左右统计成苗率，30天统计茎尖苗增殖系数及苗高。

2 结果与分析

2. 1 取材时期对茎尖诱导的影响

由表1可见，处理1～5污染率呈升高趋势，而茎尖诱导成苗率呈下降趋势。处理1与其他处理相比有一定差异，3种越橘污染率均值较低，为6.94%;茎尖诱导成苗率均值较高，为85.52%，这个阶段为最适宜取材时期。处理2污染率均值高于处理1，茎尖诱导成苗率均值与处理1无显著差异，与处理4、5差异显著。处理3污染率均值达到50%以上，成苗率均值为67.63%。处理4和处理5污染率均值较高，分别为77.42%和91.43%，茎尖诱导成苗率均值较低，分别为35.8%和11.02%。由此可见，不同取材时期茎尖污染率和诱导成苗率有很大的差异。

3种越橘的不同取材时期污染率和成苗率也存在一定的差异。休眠期取枝条室内水培催芽，美登的茎尖污染率最低、成苗率最高，分别为5.62%和90.31%。在新梢生长初期取材， 美登比红豆越橘和笃斯越桔茎尖成苗率高，为82.47%，笃斯越桔的污染率最低为18.77%。在新稍生长中期取材，红豆越橘茎尖的污染率最低、成苗率最高，分别为42.41%和71.75%。而在盛花期和秋季休眠前取材，3种越橘茎尖的成苗率均较低，不到50%，而污染率均在70%以上。对5个取材时期结果进行综合评价得出，污染率由低到高依次为休眠期枝条于温室内水培催芽<新梢生长初期枝条的顶端新萌发嫩芽<新梢生长中期的顶端嫩枝茎尖<盛花期的枝条茎尖<秋季休眠前的枝条顶端单芽茎尖。茎尖成苗率由高到低依次为美登蓝莓﹥红豆越橘﹥笃斯越桔。在休眠期和新稍生长初期取材，3种越橘茎尖污染率相对较低，诱导成苗率较高。

2. 2 消毒剂和消毒时间对茎尖诱导的影响

由表2可见，75%乙醇与0.1%升汞、2%次氯酸钠分别配合使用时，随着处理时间的增加，污染率均值呈下降趋势，而茎尖诱导成苗率均值呈先上升后下降的趋势。同样处理时间下，升汞与次氯酸钠相比，茎尖污染率较低，诱导成苗率较高，灭菌效果较好。

将75%乙醇与升汞、次氯酸钠共同配合使用，灭菌效果有所不同。红豆越橘15个处理中以处理9效果最好，即先用75%酒精灭菌30 s，再用0.1%升汞灭菌处理2 min，最后用次氯酸钠灭菌处理4 min，污染率和成苗率分别为4.65%和84.27%。笃斯越桔15个处理中以处理6效果最好，即先用75%酒精灭菌30 s，再用0.1%升汞灭菌处理4 min，最后用次氯酸钠灭菌处理2 min，污染率和成苗率分别为1.85%和78.41%。美登15个处理中以处理6效果最好，即先用75%酒精灭菌30 s，再用0.1%升汞灭菌处理4 min，次氯酸钠灭菌处理2 min，污染率和成苗率分别为2.40%和81.44%。

2. 3 不同激素对茎尖诱导的影响

将3种越橘茎尖接种到培养基上，10天左右茎尖泛绿，但3种越橘茎尖在含有激素ZT的培养基上基部多数形成愈伤组织，成苗较晚，成苗率相对较低。由表3可见，红豆越橘不同处理间茎尖成苗率存在显著差异，当6-BA为0.05 mg/L、IBA为0.5 mg/L、GA3为0.1 mg/L时，诱导成苗率最高，达84.42%;笃斯越桔不同处理间茎尖的成苗率也存在显著差异，当6-BA为0.1 mg/L、IBA为0.5 mg/L、GA3为0.1 mg/L时，成苗率最高，为83.44%;美登不同处理间达到差异显著水平，当6-BA为0.1 mg/L、IBA为0.5 mg/L、GA3为0.1 mg/L时，更利于茎尖生长，成活率可达到92.76%。不同品种茎尖生长状况有一定的差异，美登在不同激素条件下诱导成苗率要高于其他两个品种，生长更为健壮。

2. 4 培养基种类对茎尖增殖的影响

由表4可见，红豆越橘、笃斯越桔、美登由茎尖诱导的苗分别接种到3种培养基上后，在WPM（改良）培养基上增殖系数最高，均值为3.58，苗高均值为2.78 cm，且苗较健壮，接种到WPM培养基上生长次之，而接种到MS培养基上生长最差。同一种越橘在不同培养基上的增殖系数、苗高均有不同差异，红豆越橘、笃斯越桔、美登茎尖在WPM（改良）培养基上的增殖系数和平均苗高均较高，增殖系数分别为3.58、3.16和4.09，平均苗高分别为2.61、2.75和2.98 cm。因此从增殖系数、平均苗高等进行综合评价，WPM（改良）培养基为3种越橘茎尖苗增殖的最佳培养基。

2. 5 激素对不同品种茎尖增殖的影响

将3种越橘茎尖诱导的苗接种到增殖培养基上进行培养， ZT浓度对茎尖苗增殖系数影响较大，不同处理间增殖系数有一定差异。由表5可见，红豆越橘不同处理间茎尖苗增殖存在显著差异，当ZT浓度为1.0 mg/L、GA3为0.1 mg/L时，增殖系数最高达3.90，苗高为2.66 cm;笃斯越桔不同处理间茎尖苗也存在显著差异，当ZT浓度为1.0 mg/L、GA3为0.1 mg/L时，增殖系数最高达3.72，苗高也能达到中等水平，为2.51 cm;对于美登各处理间达到差异显著，当ZT浓度为1.2 mg/L、GA3为0.2 mg/L时，更利于茎尖苗增殖，增殖系数可达4.59，苗高达到2.74 cm。不同越橘茎尖生长状况有一定的差异，美登增殖能力要高于其他2种越橘，生长也更为健壮。

3 结论与讨论

3. 1 取材时期对茎尖污染率、诱导成活率影响较大。红豆越橘、笃斯越桔和美登在休眠期室内水培后萌发出的嫩芽污染最低，这个阶段可显著降低接种的污染率，提高茎尖诱导成苗率，为最适宜取材时期。新梢生长中期、盛花期以及秋季休眠前的枝条顶端茎尖，由于长时间暴露在室外，接种污染率较高，茎尖分生组织分化相对缓慢，茎尖诱导成苗率也较低，应尽量避免在这些时期取材。

3. 2 在茎尖培养过程中，培养基是影响茎尖成活率以及苗木状态的主要因素之一，红豆越橘、笃斯越桔和美登在WPM（改良）培养基上增殖系数大、生长健壮，在MS培养基上生长最差，茎尖诱导成苗率也较低。

3. 3 植物激素是影响茎尖诱导和增殖的关键因子之一，在组织培养中起着重要作用[ 18 ]。对3种越橘的研究表明，在茎尖诱导成苗过程中6-BA和IBA起着主要作用。在茎尖苗增殖过程中ZT起着关键的作用[ 19 - 20 ]，ZT浓度在0.5～2.0 mg/L的范围内3种越橘茎尖苗的增殖系数均呈先升高后下降的趋势，不同种的越橘达到最高增殖系数时所需的ZT浓度不同。当ZT浓度高于0.8 mg/L时，愈伤组织并未发生玻璃化现象，这与赵新宇（2015）[ 17 ]对蓝莓的研究结果一致，与刘树英（2002）[ 21 ]对兔眼越橘的研究不同。

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第1作者简介： 范世杰（1963-）， 男， 高级工程师。

收稿日期： 2018 - 03 - 20

（责任编辑： 张亚楠）