淫羊藿化学成分的分离与鉴定

黄楚燕 梁宏宇

摘要目的：探讨淫羊藿叶的化学组成成分。方法：使用萃取、正相硅胶、溶剂法提取法、制备高效液相色谱分析法、Sephadex LH20、反相ODS等多种分离纯化方法，来对淫羊藿叶化学成分进行分离研究，综合应用磁共振成像、质谱等方法鉴定各单体化合物结构。结果：从淫羊藿干燥叶的95%乙醇提取物（V/V）中共分离鉴定7个化合物，分别为4羟基肉桂酸甲酯；4羟基3异戊二烯基苯甲酸；3，5，7，4′四甲氧基黄酮；2，3，4，6，7五甲氧基菲；5，7，4′三甲氧基4苯基香豆素；4羟基（2E）-2壬烯酸；4，5，-二羟基2，3，6三甲氧基9，10二氢菲。结论：化合物17均为首次从淫羊藿属分离得到化合物。

关键词化学成分；淫羊藿；结构；鉴定

Isolation and Identification of Chemical Constituents of Herba Epimedii

Huang Chuyan1， Liang Hongyu2

（Department of Pharmacy， The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510405， China；

2 Second Department of Cardiovascular Diseases， Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou 510405， China）

AbstractObjective：To study chemical composition of Epimedium leaves. Methods：The extraction method， silica gel， extraction solvent， preparation of high performance liquid chromatography， Sephadex LH20， ODS and other purification methods were used to study the separation of chemical constituents of the leaves of epimedium. NMR and mass spectrometry were comprehensively applied to identify all the compounds. Results：7 compounds were isolated and identified from the 95% ethanol extract of Epimedium dry leaves （V/V）， including （1） 4hydroxy cinnamic acid methyl ester， （2） 4hydroxy3polyisoprenebenzoic acid， （3） 3，5，7，4′ tetramethoxflavone， （4） 2，3，4，6，7five methoxyPhilippines， （5） 5，7，4′trimethoxy4phenylcoumarin， （6） 4（2E）2hydroxynonenoic acid， （7） 4，5， dihydroxyl2，3，6trimethoxy9，10dihydrophenanthrene. Conclusion：Compound 17 is firstly isolated from Epimedium genus compounds.

Key WordsChemical constituents； Herba Epimedii； Structure identification

中圖分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.05.053

淫羊藿为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicomu Maxim、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum（Siebet Zucc）Maxim、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim或朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥叶，其功能是强筋骨、祛风湿、补肾阳[1]。经常被用于风湿痹痛，肾阳虚衰，筋骨微软，阳萎遗精，麻木拘挛等。主要化学成分为木脂素、黄酮、酚苷、紫罗酮类、菲等[2]。我们采用制备高效液相色谱、反相ODS、有机溶剂萃取法，结合Sephadex LH20、正相硅胶及等柱色谱法，从淫羊藿干燥叶体积分数95%乙醇提取物中分离之后，并且鉴定了7个化合物主要成分，经波谱方法鉴定其结构分别为：1）4羟基肉桂酸甲酯；2）4羟基3异戊二烯基苯甲酸；3）3，5，7，4′四甲氧基黄酮；4）2，3，4，6，7五甲氧基菲；5）5，7，4′三甲氧基4苯基香豆素；6）4羟基（2E）-2壬烯酸；7）4，5，-二羟基2，3，6三甲氧基9，10二氢菲，其中化合物17均为都是从淫羊藿属植物分离得到的[3]。

1材料与仪器

11材料淫羊藿药材是在至信集团玉林本草堂中药饮片有限公司购买的，然后通过广州中医药大学第一附属医院中药鉴定专家组鉴定为小檗科淫羊藿属植物淫羊藿（Epimedium brevicornu Maxim）的干燥叶，制作出的标本（B223）现在存放在广州中医药大学第一附属医院药学部中药仓库。

12试剂分析纯甲醇、乙醇、石油醚（60～90 ℃）、乙酸乙酯及色谱纯甲醇（广州化学试剂厂）/分析纯二氯甲烷、氯仿、丙酮（广州化学试剂厂）；ODS反相色谱柱（50 μm，120 ，日本YMC公司）；柱层析硅胶（青岛海洋化工厂分厂）；薄层层析板（德国默克公司）；Sephadex LH20（美国GE公司）[4]。

13仪器Agilent 6410三重四级杆质谱仪（美国安捷伦公司）；制备色谱柱：Agilent Eclipse XDBC18柱（250 mm×212 mm，7 μm）；制备高效液相色谱仪为Agilent 1200 series（美国安捷伦公司）；BRUKER AVANCE Ⅲ 500超导核磁共振波谱仪（瑞士布鲁克公司，TMS为内标）。

2方法

选用20 kg淫羊藿干燥叶粗粉，然后使用比干燥叶多8倍量体积分数为95%乙醇提取3次，每次提取过程都必须严格控制用量，提取一次的时间为2 h，然后过滤，回收，最后放到真空条件干燥回收[5]。之后取3 000 g样品，向样品中加入离子水10 000 mL混悬，使用等体积的乙酸乙酯萃取回收3次，合并乙酸乙酯层，干燥收集得乙酸乙酯萃取物约1 000 g。最后对萃取物进行硅胶柱层析分离，二氯甲烷丙酮（1∶0→10∶1→5∶1，2∶1→1∶1→0∶1）梯度洗脱，薄层（TLC）检识，合并相同流分，得8个流分（Fr18）[6]。

Fr2（100 g）在硅膠柱色谱，通过石油醚丙酮（100∶0→0∶100）梯度洗脱，TLC鉴别检识，然后回流得到12个流分，其中Fr112（620 mg）经ODS开放在柱色谱与制备高效液相色谱制备得到了化合物1（23 mg）[7]。Fr4（112 g）经硅胶柱色谱，石油醚丙酮（100∶0→0∶100）梯度洗脱，从而得到了8个流分，其中Fr47（1 120 mg）通过ODS开放在柱色谱和制备高效液相色谱分离得到了化合物2（34 mg）和化合物4（90 mg）；Fr8（130 g）经硅胶柱色谱，二氯甲烷甲醇（100∶0→0∶100）梯度洗脱，TLC检识，合并处理回收得到15个流分，Fr815（620 mg）经sephadex LH20及ODS开放柱色谱和制备高效液相色谱分离，从而得到了化合物6（35 mg）[8]；其中Fr88（510 mg）经sephadex LH20（甲醇洗脱）及ODS开放柱色谱和制备高效液相色谱分离得到了化合物5（65 mg）；Fr6（160 g）经ODS开放柱色谱和制备高效液相色谱分离得到了化合物7（20 mg）；Fr48（935 mg）经ODS开放在柱色谱与制备高效液相色谱分离得到了化合物3（10 mg）。

3结果

化合物1：颜色是白色，形状是无定形，状态是粉末，可以在甲醇中溶解。在正离子ESIMS谱中，可以观测到准分子离子峰m/z：3129[M+H]+，推测其分子量为312。在中高场区可以观测到3个甲氧基质子信号：δ 399（3H，s，7OCH3），388（3H，s，5OCH3），381（3H，s，4′OCH3）。在13CNMR（125 MHz，CD3OD）谱上出现1个内酯羰基信号：δ1789（C2）；14个相应的芳香碳信号：δ1243（C1′），1081（C3），1624（C4），942（C8），1622（C8a），1630（C5），994（C6），1668（C7），1156（C3′，5′），1091（C4a），1291（C2′，6′）和1643（C4′）；还可观测到3个孤立的芳香质子信号：δ 651（1H，s，H6），666（1H，s，H8），656（1H，s，H3）。碳谱中还可观测到3个甲氧基信号：δ560（5OCH3），576（7OCH3）和565（4′OCH3）。1H、13CNMR谱数据与文献中出现化合物的成分一样，由此可得该化合物1为5，7，4′三甲氧基4苯基香豆素[9]。

化合物2：颜色是白色，形状是无定形，形态是粉末，在甲醇中可以溶解。在正离子MS谱中，可以观察到到准分子离子峰m/z：3291[M+H]+，推测其分子量为328。在1HNMR（500 MHz，CD3OD）谱低场区，可以在中高场区可以观测到5个甲氧基质子信号δ401（3H，s，6OCH3），δ 397（3H，s，7OCH3），398（3H，s，2OCH3），397（3H，s，3OCH3），399（3H，s，4OCH3）。看到5个芳香氢质子信号：δ903（1H，s，H5）；757（1H，d，J=85 Hz，H9），752（1H，d，J=85 Hz，H10），δ 719（1H，s，H1），730（1H，s，H8），观察到5个甲氧基信号：δ 563（7OCH3），617（3OCH3），562（2OCH3），564（6OCH3），611（4OCH3）。13CNMR（125 MHz，CD3OD）谱上出现14个相应的芳香碳信号：δ 1312（C10a），1066（C1），1273（C9），1532（C2），1438（C3），1097（C8）1496（C7），1527（C4），1289（C8a），1089（C5），1502（C6），1260（C10），1197（C4a），1256（C4b），以及1H、13CNMR谱数据与文献对照，结果基本一致，鉴定化合物2为2，3，4，6，7五甲氧基菲[10]。

化合物3：颜色是黄色，形状是无定形，形态是粉末，在甲醇中可以溶解。在正离子ESIMS谱中，观察到准分子离子峰m/z：3429[M+H]+，推测其分子量为342。低场区可观测到B环的一组AA′BB′芳香氢信号：δ809（2H，d，J=90 Hz，H2′，6′），715（2H，d，J=90 Hz，H3′，5′），提示B对位取代；在13CNMR（125 MHz，CD3OD）谱上出现黄酮苷元相应的碳信号：δ 1230（C1′），1555（C2），1609（C9），1161（C3′，5′），1652（C4′），1311（C2′，6′），1489（C3），1760（C4），1663（C5），991（C6），1664（C7），918（C8），1128（C10），以及4个甲氧基信号：δ 603（3OCH3），576（5OCH3），596（7OCH3）和561（4′OCH3）[11]。还可观测到4个甲氧基质子信号：δ 392（3H，s，7OCH3），379（3H，s，3OCH3），388（3H，s，4′OCH3）和391（3H，s，5OCH3）。除此之外，还可观测到4个甲氧基质子信号：δ 399（3H，s，7OCH3），389（3H，s，3OCH3），387（3H，s，4′OCH3），391（3H，s，5OCH3）。1H、13CNMR谱数据与文献中出现化合物的成分一样，由此可得该化合物是3，5，7，4′四甲氧基黄酮[12]。

化合物4：颜色是白色形状是无定形粉末，可以在甲醇溶解。在测定正离子ESIMS谱中，可以观察到准分子离子峰m/z：3050[M+H]+，推测其分子量为302。在1HNMR（500 MHz，CD3OD）谱低场区，可以在高场区观测到一组脂肪氢质子信号：δ 261（4H，br s，H9，10）和3个甲氧基质子信号δ 381（3H，s，3OCH3），389（3H，s，6OCH3），388（3H，s，2OCH3）。观测到3个芳香氢质子信号：δ 668（1H，s，H1），670（1H，d，J=80 Hz，H8），684（1H，d，J=80 Hz，H7）；在13CNMR（125 MHz，CD3OD）谱上出现12个相应的芳香碳信号：δ 1056（C1），1426（C2），1338（C8a），1534（C3），1378（C4），1493（C5），1499（C6），1101（C7），1202（C8），1164（C4a），1244（C4b）和1387（C10a），可以观察到2个脂肪碳和3个甲氧基信号：δ566（6OCH3），315（C9），569（2OCH3），327（C10），612（3OCH3），可以在13CNMR（125 MHz，CD3OD）谱上出现12个相应的芳香碳信号：δ 1056（C1），1202（C2），1108（C3），1534（C4），1378（C5），1252（C6），1264（C4a），1483（C7），1426（C8），1490（C9），1154（C4b），1368（C8a）和1387（C10a）。1H、13CNMR谱数据与文献出现的化合物成分一样，由此可得化合物4为4，5，-二羟基2，3，6三甲氧基9，10二氢菲[13]。

化合物5：颜色是白色，形态是粉末，在氯仿中可以溶解。在正离子ESIMS谱中，观察到准分子离子峰m/z：2071[M+H]+，推测其分子量为206。13CNMR（125 MHz，CD3OD）谱上出现6个相应的芳香碳信號：δ1315（C1），1143（C2），1215（C3），1861（C4），1315（C5），1194（C6）；1个羰基碳信号δ1705（C7），及一组异戊二烯基信号δ250（C1′），291（C2′），1233（C3′），179（C4′），1337（C5′）。在1HNMR（500 MHz，CD3OD）谱低场区，可以详细观察到一组ABX芳香氢质子信号：δ764（1H，d，J=20Hz，H2），677（1H，d，J=80 Hz，H5），779（1H，dd，J=20，811 Hz，H6）；还可以观测到1个烯氢信号：δ533（1H，t，J=75Hz，H2′）；另外，在高场区可以观察到一组脂肪氢质子信号：δ 329（2H，m，H1′）及2个甲基质子信号δ 171（3H，s，H5′），175（3H，s，H4′）。1H、13CNMR谱数据与文献[14]对照，结果基本一致，鉴定化合物5为4羟基3异戊二烯基苯甲酸。

化合物6：颜色是白色，形状是无定形，形态是粉末，在甲醇中可以溶解。在正离子ESIMS谱中，观察到准分子离子峰m/z：1731[M+H]+，推测其分子量为172。氢谱中还可观测到：δ，155（2H，m，H5），113（4H，m，H6，8）；419（1H，dd，J=50，110Hz，H4），099（3H，t，J=70 Hz，H9），135（2H，m，H7）；在1HNMR（500 MHz，CD3OD）谱低场区，也可以观察到一组反式烯氢质子信号：δ 596（1H，dd，J=15，170 Hz，H2），691（1H，dd，J=51，160 Hz，H3）。碳谱中还有1个羰基碳信号δ1702（C1）。在13CNMR（125 MHz，CD3OD）谱上出现2个相应的烯碳信号：δ319（C8），1221（C2），234（C6），144（C9），1517（C3），718（C4），386（C5），229（C7）；1H、13CNMR谱数据与文献中出现的化合物成分一样，由此可得化合物6为4羟基（2E）-2壬烯酸[15]。

化合物7：颜色是白色，形状是无定形，形态是粉末，在甲醇中可以溶解[16]。在正离子ESIMS分析光谱中，可以观察到准分子离子峰m/z：1791[M表17种物质颜色形状等比较项四甲氧基黄酮4，5，-二羟基2，3，6三甲氧基9，10二氢菲。4羟基3异戊二烯基苯甲酸4羟基（2E）-2壬烯酸4羟基肉

桂酸甲酯颜色白色白色白色白色白色黄色白色形状无定型粉末无定型粉末无定型粉末无定型粉末粉末粉末粉末是否溶于甲醛是是是是否是是

+H]+，推测其分子量为178。在1HNMR（500 MHz，CD3OD）谱低场区，可以清楚观察到一组AA′BB′芳香氢质子信号：δ 346（3H，s，9OCH3）；在14CNMR（126 MHz，CD3OD）谱上出现6个相应的芳香碳信号：δ1623（C4），1283（C1），1119（C3，5），1312（C2，6）[17]；在1HNMR（500 MHz，CD3OD）谱低场区，也可以清楚观察到一组AA′BB′芳香氢质子信号：δ728（2H，d，J=91Hz，H2′，6′），685（2H，d，J=90Hz，H3′，5′），一对烯碳信号：δ1478（C7），1194（C8），1个羰基碳信号δ1677，以及1个甲氧基信号δ 489；及一对反式烯氢信号：δ 630（1H，d，J=160 Hz，H8），769（1H，d，J=160 Hz，H7）；1H、13CNMR谱数据和文献出现的数据结果一样，由此可得该化合物是4羟基肉桂酸甲酯[18]。

5，7，4′三甲氧基4苯基香豆素。2，3，4，6，7五甲氧基菲。3，5，7，4′四甲氧基黄酮。4，5，-二羟基2，3，6三甲氧基9，10二氢菲。4羟基3异戊二烯基苯甲酸。4羟基（2E）-2壬烯酸。4羟基肉桂酸甲酯，7种物质颜色形状等比较见表1。

4讨论

在淫羊藿叶样品中通过分离得到了7个化合物，分别为：5，7，4′三甲氧基4苯基香豆素；2，3，4，6，7五甲氧基菲；3，5，7，4′四甲氧基黄酮；4，5，-二羟基2，3，6三甲氧基9，10二氢菲；4羟基肉桂酸甲酯；4羟基（2E）-2壬烯酸；4羟基3异戊二烯基苯甲酸（7）[19]。化合物17为首次从淫羊藿属分离得到化合物。

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（2017-05-17收稿責任编辑：杨觉雄）