达氏鲟维氏气单胞菌的分离鉴定及病理组织学观察

刘亚　杨锐　陈叶雨　宋明江　颜其贵　龚全　李强　杨焕超　赖见生

摘要：【目的】查明引起达氏鲟（Acipenser dabryanus）发病死亡的病原菌及其耐药性，为该病的临床诊断和科学防治提供参考依据。【方法】以常规方法对患病达氏鲟的鳃、心脏、肝脏和肠道等组织进行病原菌分离纯化，采用形态学观察、生理生化特性鉴定与16S rRNA序列分析相结合的方法进行鉴定，通过人工感染试验明确病原菌的致病性及其病理组织学特征，并以K-B纸片扩散法进行药敏试验。【结果】从患病达氏鲟的肝脏组织中分离获得一株优势菌株（AD-AV201606），经形态学观察、生理生化特性鉴定及16S rRNA序列分析，最终鉴定为维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）。以维氏气单胞菌人工感染达氏鲟，可复制出与自然发病相同的临床症状，感染引起的死亡率为50%～80%，且病鱼集中在感染后1～3 d死亡。药敏试验结果表明，达氏鲟维氏气单胞菌对庆大霉素、链霉素、左氧氟沙星、四环素、环丙沙星、阿奇霉素和头孢呋辛等7种抗生素敏感，对青霉素和利福平已产生耐药性。维氏气单胞菌感染对达氏鲟造成的组织病理变化主要集中在肝脏、肠道及鳃组织。【结论】维氏气单胞菌对达氏鲟有较强的致病性，通过引起肝脏、肠道及鳃等器官组织的病理变化而造成机体损伤甚至死亡，生产上可选用庆大霉素、链霉素和四环素进行防治。

关键词： 达氏鲟；维氏气单胞菌；分离鉴定；药敏试验；病理组织学

中图分类号： S941.42 文献標志码：A 文章编号：2095-1191（2018）06-1235-07

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to investigate pathogenic bacteria that caused death of Acipenser dabryanus and its susceptibility in order to provide references for the clinical diagnosis and scientific prevention of the disease. 【Method】Bacterial isolates were collected from gill， heart， liver and intestines of diseased A. dabryanus by conventional methods. After being purified， the pathogen was identified based on morphological observation， biochemical characteristics together with 16S rRNA sequence analysis. The pathogenicity and histological characteristics of pathogenic bacteria were determined by artificial infection. Drug susceptibility was detected by Kirby-Bauer disk diffusion method. 【Result】A dominant strain（AD-AV201606） was isolated from the liver tissue of the diseased A. dabryanus. The pathogenic bacteria was finally identified as Aeromonas veronii after morphological observation. Biochemical characteristics test together with 16S rRNA sequence analysis. The infection symptoms of the fishes by artificial infection germs appeared the same as the natural infection， with mortality rate of 50%-80%. The infected A. dabryanus died 1-3 d after infection. Drug sensitivity test showed that the isolated bacterium was highly sensitive to seven kinds of antibiotics including gentamicin， streptomycin， levofloxacin， tetracycline， ciprofloxacin， azithromycin and cefuroxime. The bacterium had resistance to penicillin and rifampicin. The histological changes of sturgeon caused by A. veronii infection were mainly concentrated in the liver， intestinal tract and gill tissues. 【Conclusion】A. veronii had strong pathogenicity on A. dabryanus. It leads to body damage and even death of A. dabryanus by causing pathological changes in liver， intestine and gill. Gentamicin， streptomycin and tetracycline can be selected for prevention and treatment of the disease in production.

Key words： Acipenser dabryanus； Aeromonas veronii； isolation and identification； drug sensitivity test； histopathology

0 引言

【研究意义】达氏鲟（Acipenser dabryanus）又称长江鲟、沙腊子，隶属于鲟形目（Acipenseriformes）鲟科（Acipenseridae）鲟属（Acipenser），主要分布于长江中上游干流及金沙江下游，是我国的特有物种。达氏鲟种群资源在长江上游已严重衰退，野生数量极其稀少，于1988年被列为国家一级重点保护动物（陈细华，2007）；按照世界自然保护联盟（IUCN）（http：//www.iucnredlist.org/）的评估结果，达氏鲟已处于极度濒危级（CR）。开展达氏鲟人工繁育及养殖是保护其物种资源的重要措施，但在达氏鲟的人工养殖过程中常因持续高温、水质恶化或病原菌感染等而极易引发疾病（宋振荣等，2003；张佐等，2016），不利于该物种的保护。因此，有针对性地开展病原菌研究并提出防治措施，对实现达氏鲟健康养殖及其物种资源保护均具有重要意义。【前人研究进展】由于达氏鲟分布的局限性，目前针对该物种的研究报道主要见于国内，研究领域主要集中在人工繁殖（龚全等，2013）、亲本鉴定（骆慧，2013；Liu et al.，2017）、相关基因的克隆与表达分析（单喜双等，2015；杜浩等，2017）等，而有关达氏鲟疾病的研究报道甚少。宋振荣等（2003）对患病达氏鲟的组织器官进行病理学研究，认为持续高温和水质恶化与其心外膜囊肿症的发生密切相关，运用电子显微镜观察各脏器的病灶组织，但未发现有细菌、病毒或寄生虫等病原体。鲁雪报等（2012，2013）对达氏鲟常见发病特征及防治措施进行研究，认为通过全面预防和及时治疗能有效减少或减轻鱼病的危害，但尚未开展相关病原菌的鉴定研究。张佐等（2016）从四川泸州某养殖场的患病达氏鲟分离获得嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila），该病原菌引起的临床症状表现为病鱼尾柄鳞基部有突出体外的充血泡，腹部肿胀，鳃丝腐烂，脏器有出血点等，生产上可选用头孢曲松、恩诺沙星和氟苯尼考等抗生素进行防治。【本研究切入点】2016年8月四川省农业科学院水产研究所培育的一批达氏鲟幼鱼发病死亡，病鱼主要表现为食欲明显减弱，缓慢游于水面或侧翻，反应迟钝，部分病鱼鳍条及腹部体表出血，鰓丝充血，肛门红肿；剖检可见病鱼肠道出血，无内容物，肠壁有较多黄色黏液，腹腔积水；发病后48 h的累积死亡率达70%，造成严重的经济损失。【拟解决的关键问题】对患病达氏鲟的鳃、心脏、肝脏和肠道等组织进行病原菌分离纯化，采用形态学观察、生理生化特性鉴定与16S rRNA序列分析相结合的方法进行鉴定，通过人工感染试验明确病原菌的致病性及其病理组织学特征，并以K-B纸片扩散法进行药敏试验，以期为该病的临床诊断和科学防治提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

患病达氏鲟和健康达氏鲟均由四川省农业科学院水产研究所提供。其中，患病达氏鲟共6尾，体重40～52 g/尾，体长21～25 cm；健康达氏鲟（用于人工感染试验）体重42～47 g/尾，体长22～26 cm，试验前隔离暂养观察30 d，暂养期间正常投喂管理，随机选取3尾以常规方法对其肝脏和心脏组织进行病原菌检测，结果均呈阴性。MH培养基琼脂购自北京索莱宝科技有限公司，细菌微量生化反应管和标准药敏试纸购自杭州微生物试剂有限公司，细菌基因组DNA抽提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司，2×Taq PCR Master Mix购自成都擎科梓熙生物技术有限公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 病原菌分离 无菌操作采集患病达氏鲟的病料组织，取样接种于MH固体培养基和液体培养基，28 ℃培养18～24 h，观察病原菌的生长情况；再挑取单菌落进行纯化培养，纯化所得菌株转接到斜面营养琼脂培养基上，28 ℃培养24 h后观察菌落形态特征，并进行革兰氏染色镜检；部分纯化菌株4 ℃保存备用。

1. 2. 2 生理生化特性鉴定 挑取纯化的单个菌落接种于MH液体培养基，然后将培养物接种于细菌微量生化反应管中，28 ℃培养24 h后，对乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶等生理生化指标进行测定，并参照《常见细菌系统鉴定手册》及黎炯等（2011）、杨移斌等（2014）的方法对病原菌进行初步判定。

1. 2. 3 16S rRNA序列分析 选取纯化的单个菌落接种于MH液体培养基以获得菌悬液，以细菌基因组DNA抽提试剂盒提取其DNA，采用16S rRNA通用引物（16S-F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，16S-R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增。PCR反应体系50.0 μL，其中2×Taq PCR Master Mix 25.0 μL，上、下游引物各2.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 19.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 S，56 ℃ 30 s，72 ℃ 50 S，进行35个循环；最后72 ℃延伸10 min。取5.0 μL PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性产物送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，选取相似度较高的同种菌株及相关同属菌株序列，采用ClustalX 2.0进行多序列比对分析，再以MEGA 7.0中Neighbour-Joi-ning法构建系统发育进化树，通过1000次Bootstrap检验置信度。

1. 2. 4 人工感染回归试验 将纯化菌株接种于MH固体培养基上，28 ℃培养18～24 h后用灭菌的0.65%生理盐水洗下菌落制成菌悬液，采用平板计数法测定菌悬液浓度。健康达氏鲟随机分成4组，每组10尾。其中3组于胸鳍下注射菌悬液（0.2 mL/尾），对应的菌悬液浓度分别为1.0×107、1.0×108和1.0×109 CFU/mL，另一组于胸鳍下注射等量的0.65%生理盐水作为对照（CK）。试验期间连续充气供氧，水温保持在（20±1）℃，每日正常投喂饵料并清污，定期观察鱼的活动情况，连续观察1周并记录达氏鲟的发病及死亡情况。无菌采集人工感染死亡达氏鲟的鳃、心脏、肝脏和肠组织，再次进行病原菌分离鉴定。

1. 2. 5 药敏试验 菌悬液用灭菌0.65%生理盐水稀释为0.5倍麦氏浓度后，用棉拭子蘸取菌悬液均匀涂布MH培养基，然后用镊子将各药敏纸片紧贴在MH培养基表面。每张药敏纸片间距≥24 mm，药敏纸片中心距平皿边缘≥15 mm。28 ℃培养18～24 h后观察细菌生长情况，测量抑菌圈直径（mm），并根据美国临床实验室标准化研究所（CLSI）的抗菌药物敏感性试验执行标准判定菌株对抗生素的敏感性。

1. 2. 6 病理组织切片观察 无菌采集人工感染死亡达氏鲟的鳃、肝脏、胃、鳔及肠道组织，用10%中性福尔马林溶液固定，经石蜡包埋、切片和HE染色，光学显微镜下观察达氏鲟的组织病理学变化，并对其进行图像采集和描述。

2 结果与分析

2. 1 病原菌分离结果

从患病达氏鲟的肝脏组织中分离获得一株优势菌株，将纯化后的菌株命名为AD-AV201606。该菌株在营养琼脂培养基上生长形成的菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，灰白色，不透明，中央稍隆起；革兰氏染色呈阴性。

2. 2 分离菌株的生理生化特性

对菌株AD-AV201606进行生理生化特性鉴定，结果（表1）显示，该分离菌株可利用葡萄糖而產酸、产气，能利用半乳糖并水解明胶，鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶及V-P试验均呈阳性，但阿拉伯糖、乳糖、硫化氢、枸橼酸盐、丙二酸、甘露醇和D-山梨醇等7项检测结果呈阴性。该分离菌株的大部分生理生化特性与维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）相符，初步判定为维氏气单胞菌。

2. 3 分离菌株的16S rRNA序列分析结果

扩增得到菌株AD-AV201606的16S rRNA序列长度为1385 bp，其GenBank登录号为MG736237。将该序列在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，结果发现其与维氏气单胞菌标准菌株ATCC 35624的同源性达100%。选取相似度高的同种菌株及相关同属菌株序列进行多序列比对分析，再基于16S rRNA序列构建系统发育进化树（图1），结果显示菌株AD-AV201606与维氏气单胞菌先聚为一个分支。综合分离菌株的形态特征及生理生化特性，可确定该分离菌株即为维氏气单胞菌。

2. 4 人工感染回归试验结果

以菌株AD-AV201606的菌悬液人工感染健康达氏鲟，其临床症状主要表现为鱼体反应较迟钝，鳃丝充血，鳍条及腹部体表出血，肛门红肿（图2-A）；剖检发现其腹腔积液（图2-B），肠道内充满黄色黏液（图2-C）。对照组达氏鲟的摄食、活动正常，外观体表未见异常（图2-D），连续观察1周未发现死亡现象。再次取样进行病原菌分离鉴定，其菌落形态特征、生理生化特性及16S rRNA序列与菌株AD-AV201606一致，即菌株AD-AV201606是引起达氏鲟发病死亡的致病菌。由表2可看出，菌株AD-AV201606对达氏鲟有较强的致病性，于胸鳍下注射不同浓度（1.0×107、1.0×108和1.0×109 CFU/mL）菌悬液感染引起的死亡率为50%～80%，且病鱼集中在感染后1～3 d死亡，第4 d后未见病鱼死亡。

2. 5 药敏试验结果

由表3可知，菌株AD-AV201606对庆大霉素、链霉素、左氧氟沙星、四环素、环丙沙星、阿奇霉素和头孢呋辛等7种抗生素敏感，但对青霉素和利福平已产生耐药性。

2. 6 病理组织切片观察结果

光学显微镜下观察人工感染死亡达氏鲟的鳃、肝脏、胃、鳔及肠道等病理组织切片，结果发现病理损伤部位主要集中在肝脏、肠道及鳃组织。其中，肝脏组织中可见大量黑色素巨噬细胞（图3-A），肝血窦瘀血，红细胞充盈，狄氏间隙增宽（图3-B）。肠道病理特征表现为肠黏膜下层细胞增多，部分区域的肠黏膜坏死脱落，肠腔内有脱落的上皮组织（图3-C）；肠黏膜层及黏膜下层的毛细血管充血扩张，大量红细胞充盈，肠黏膜上皮层变薄，大量上皮细胞脱落（图3-D）。鳃小片的呼吸上皮极度浮离（图3-E），鳃小片呼吸上皮及基部细胞大量坏死，脱落（图3-F）。

3 讨论

维氏气单胞菌隶属气单胞菌科（Aeromonadaceae）气单胞菌属（Aeromonas），也称为维罗纳气单胞菌和威（维）隆气单胞菌，广泛分布于水环境、土壤及动物消化道中，可引起人类腹泻、胃肠炎及呼吸道感染（许少洪和李映霞，2010；王惠，2014）。田小龙等（2015）从猪—鱼立体养殖鱼塘的池塘水、养殖鱼类及池塘底泥样品中分离出维氏气单胞菌，并证实苯扎溴铵对其杀菌效果良好。近年来，维氏气单胞菌多次在水产动物疾病中被报道，可感染中华绒螯蟹（房海等，2008）、斑点叉尾鮰（黄小丽等，2010）、罗非鱼（黎炯等，2011）、大鲵（王旭等，2011）、鳗鲡（杨求华等，2012）、白缘?（杨泽晓等，2012）、黄颡鱼（朱成科等，2013）及鲫鱼（张冬星等，2017）等多种水产动物，主要引起出血和腹水等症状，对水产养殖业危害较大。有关维氏气单胞菌感染鲟鱼的研究报道较少，马志宏等（2009）首次在患病西伯利亚鲟体内分离获得鲟源维氏气单胞菌，并通过人工感染试验确认该菌的致病性；杨移斌等（2014）从患病西伯利亚鲟和施氏鲟中均分离得到维氏气单胞菌，人工感染试验发现96 h内的累计死亡率分别高达70%和80%，说明维氏气单胞菌对西伯利亚鲟和施氏鲟具有很强的致病性；田照辉等（2015）研究了西伯利亚鲟对维氏气单胞菌感染的生理免疫反应，证实血清皮质醇含量和溶菌酶活力升高可作为机体免疫状态的参考指标。本研究从患病达氏鲟肝脏组织分离获得维氏气单胞菌，人工感染试验结果表明，维氏气单胞菌对达氏鲟有较强的致病性，感染引起的病理损伤部位主要集中在肝脏、肠道和鳃组织，发病死亡率在50%～80%，且病鱼集中在感染后1～3 d死亡。

目前，水产动物养殖生产上主要采用抗生素控制病原菌的发生和流行。因此，针对病原菌开展药敏试验，准确筛选出病原菌的敏感药物，对科学指导生产用药、有效防治疾病及保障水产品质量安全均具有重要意义。本研究的药敏试验结果表明，达氏鲟源维氏气单胞菌对庆大霉素、链霉素、左氧氟沙星、四环素、环丙沙星、阿奇霉素和头孢呋辛等7种抗生素敏感，对青霉素和利福平已产生耐药性。其中，达氏鲟维氏气单胞菌对阿奇霉素、庆大霉素及链霉素敏感，对青霉素耐受的结果与杨泽晓等（2012）、朱成科等（2013）的研究报道一致，但对四环素和环丙沙星的敏感性在不同研究报道中存在一定差异，可能与菌株的来源及地区间的用药差异有关，具体原因有待进一步探究。由于环丙沙星、氧氟沙星等抗生素属于水产禁用药物或禁止在饲料和动物饮水中使用的添加剂，生产上用药原则既要考虑药物的敏感性，又要严格遵守水产用药的规定，因此建议选用庆大霉素、链霉素和四环素进行防治。

维氏气单胞菌对达氏鲟造成的组织病理变化与其感染斑点叉尾鮰（黄小丽等，2010）、齐口裂腹鱼（谢光美等，2015）、虹鳟（王兴丽等，2016）等鱼类引起的组织病理变化特征相似，病理损伤多集中在重要的功能器官组织，如肝脏、肠道及鳃组织，主要引起这些器官组织发生衰退性病变及坏死。从达氏鲟的组织病理变化也可看出，維氏气单胞菌具有较强的致病性。肝血窦淤血则阻碍肝细胞与血液间的物质交换，最终影响肝脏的解毒、防御及分泌等功能；肠黏膜坏死脱落，则对其营养吸收等造成影响；鳃小片呼吸上皮及基部细胞的大量死亡，可致使呼吸功能减弱，甚至缺氧窒息。说明维氏气单胞菌是通过引起多个器官组织发生病理变化，进而造成机体损伤甚至死亡。

4 结论

维氏气单胞菌对达氏鲟有较强的致病性，通过引起肝脏、肠道及鳃等器官组织的病理变化而造成机体损伤甚至死亡，生产上可选用庆大霉素、链霉素和四环素进行防治。

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（責任编辑 兰宗宝）