茧丝腐化液微生物群落分析及脱胶功能菌的筛选

李丹　程明　方佳　李乔兰　吴重德　周荣清

摘要： 为了选育稳定高效的茧丝脱胶菌株，文章首先利用PCRDGGE技术对茧丝腐化液微生物群落结构进行了解析，研究结果表明，腐化液的优势菌属为芽孢杆菌属（Bacillus）。对腐化液中脱胶微生物进行了筛选，获得了一株脱胶率较高的菌株，经16S rDNA分子鉴定，命名为Aeromonas sp. TJ5。对脱胶菌株脱胶条件进行了优化，获得了最适的pH值、温度和接种量，分别为pH7.0、37℃和3%。在优化的培养条件下发酵48h，脱胶率达到28.2%，蛋白酶活力为59.5U/mL。研究结果为建立茧丝的微生物纯种发酵工艺奠定了基础。

关键词： 脱胶；微生物群落；气单胞菌；腐化液；分离鉴定

中图分类号： TS195.2文献标志码： A文章编号： 10017003（2018）04000106引用页码： 041101

Abstract： In this study， to screen stable and highactivity strains for silk degumming， microbial community structure of silk natural fermentation liquid was firstly investigated by PCRDGGE technology， and the results showed that the dominant genus was Bacillus. Screening of degumming microorganism possessing from silk natural fermentation liquid was performed， and a bacterium with high degumming rate was obtained. The bacterium was named Aeromonas sp. TJ5 based on 16S rDNA molecular identification. The degumming conditions of TJ5 were optimized， and the optimal pH， temperature and inoculum concentration were pH 7.0， 37℃， and 3%， respectively. After cultivation for 48h under the optimal conditions， the degumming rate and protease activity reached 28.2% and 59.5U/mL， respectively. These results may contribute to developing a new degumming process for pure microbial fermentation.

Key words： degumming； microbial community； Aeromonas； silk natural fermentation liquid； isolation and identification

繭丝由丝素和丝胶构成，分别占茧丝含量的70%～80%和20%～30%[12]。由于丝胶过多会影响蚕丝的光泽和手感，通常需要将过量的丝胶脱除。在养蚕、制丝及丝织行业还将剔选出大量不适合缫丝的下茧、工业废丝及下脚料成为绢纺原料。这些原料含有大量丝胶、油脂、杂质等，必须通过工艺处理脱除大部分胶质、油脂等。目前绢纺工业脱胶常用的方法有化学法和腐化化学法。化学脱胶主要利用碱溶液进行煮练，缺点是化学试剂用量大、污染环境严重、耗水、耗能、脱胶不均匀、对纤维损伤大[34]。腐化法又称生物法，是一种自然发酵法。利用自然形成的微生物体系进行生物脱胶，作用温和、污染少[5]。但由于是混菌发酵，微生物群落结构复杂，发酵过程不易控制，产品质量不稳定。如果能从腐化液中筛选具有脱胶能力的菌株，然后采用纯种发酵的方式进行脱胶，既可以减少杂菌污染，同时可以提高脱胶效率并稳定产品品质。近年来，许多研究者从腐化液中分离筛选出高效脱胶菌株，利用纯种微生物或微生物产生的酶进行脱胶，取得了良好效果[1，68]。本文利用PCRDGGE技术对茧丝腐化液微生物群落进行研究，从腐化液中筛选具有脱胶功能的菌株，并分析菌株脱胶性能，研究结果为绢纺原料的微生物脱胶奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料

茧丝及腐化液（四川省南充银海丝绸有限公司）。

1.1.2主要试剂和仪器

土壤总DNA提取试剂盒（美国OMEGA公司），2×PCR Master Mix和PCR产物纯化试剂盒（北京天根生化科技有限公司），琼脂糖、丙烯酰胺、N，N甲叉丙烯酰胺、甲酰胺、TEMED、SYBR Green I染料（成都博瑞克试剂有限公司），其他试剂均为分析纯。

BioRad S1000PCR仪、水平电泳仪及DGGE仪、GEL Doc+凝胶成像仪（美国BioRad公司）。

1.1.3培养基

1）种子培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH7.0，0.1MPa灭菌20min；

2）筛选培养基：酪素4g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钠1.5g/L，氯化钠1g/L，七水硫酸镁0.2g/L，pH7.0，0.1MPa灭菌20min；

3）脱胶培养基：硝酸铵1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钠1.5g/L，氯化钠1g/L，七水硫酸镁0.2g/L，pH7.0，0.1MPa灭菌20min。

1.2方法

1.2.1茧丝腐化液总DNA的提取

准确量取80mL废水样品，离心（10000r/min、4℃）10min，收集沉淀，重悬于25mL磷酸缓冲液（PBS、0.05mol/L、pH8.0）中，漩涡混匀5min，再低速（800r/min、4℃）离心10min，收集上层悬浊液。加入25mL相同的PBS离心（800r/min、4℃）洗涤沉淀物2次，汇集收集的悬浊液，离心（10000r/min、4℃）分离10min，收集沉淀物。

将收集到的细菌沉淀用土壤总DNA提取试剂盒提取样品总DNA。根据试剂盒说明书提取DNA后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的大小及纯度；提取的总DNA置于-20℃冰箱中保藏待用。

1.2.2PCR扩增

参考文献[9-10]中所述方法，采用巢式PCR方式进行，扩增引物及扩增条件如表1所示。扩增体系为50μL︰2×Taq Master Mix25μL，正反引物各2μL（10mM），模板2μL，ddH2O 19μL。

1.2.3DGGE分析

DGGE采用8%的胶浓度，变性剂浓度梯度为30%～60%，每一泳道载样量为80μL。DGGE分析在Dcode通用基因突变检测系统中进行，在60℃、150V条件下，电泳5h。电泳结束后，DGGE凝胶用SYBR Green I染色30min，随后在GEL Doc+凝胶成像仪中成像。将得到的DGGE条带进行切胶回收，置于1.5mLEP管中，捣碎并用40μL ddH2O浸泡，4℃下静置过夜。取2μL过夜后的上清液作为模板，进行第二轮的PCR扩增，将产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行后续的克隆及测序。

1.2.4脱胶微生物的分离及筛选

吸取1mL茧丝腐化液至含有9mL无菌水的EP管中，振荡分散后，梯度稀释涂布于牛种子（固体）培养基平板中，30℃培养24h。随机挑选单菌落经划线分离为纯菌落，接种到牛肉膏蛋白胨斜面培养基中培养。

初筛：将上述挑选的单菌落点种于筛选培养基平板上，置于30℃培养箱中培养24h。根据菌落周围的透明圈直径（D）与菌落直径（d）之比（D/d），选出比例较大的菌株进行下一步筛选。

复筛：将初筛获得的菌株活化，接种至装有100mL脫胶培养基的250mL三角瓶中，置于30℃培养箱中脱胶培养48h，脱胶完成后，将茧丝样品取出、冲洗干净，再放入干燥箱中恒重。根据脱胶处理后茧丝损失的质量来筛选出最佳的脱胶菌种。

1.2.5菌株16S rDNA鉴定

离心收集培养至对数生长后期的菌体，采用Bacterial DNA Kit试剂盒提取菌株总DNA。采用细菌通用引物27f和1492r（表1）对总DNA进行PCR扩增，扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。将测序得到的16S rDNA序列用BLAST软件与GenBank数据库做相似性分析。

1.2.6菌株脱胶条件的优化

分别考察了培养基初始pH值、培养温度和接种量对菌株脱胶效率的影响。pH值对脱胶的影响：将脱胶培养基的pH值分别调至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，按1%的接种量接种菌株TJ5，加入1g茧丝样品，置于30℃培养箱中培养48h，测定茧丝脱胶率；温度对脱胶的影响：按1%接种量向脱胶培养基中（pH7.0）接入菌株TJ5，并加入1g茧丝样品，将其分别置于20、25、30、37、42℃恒温培养箱内培养48h，测定茧丝脱胶率，获得最优的脱胶温度；接种量对脱胶率的影响：分别按1%、2%、3%、5%、7%的接种量将菌株TJ5接种至脱胶培养基中（pH7.0），加入1g茧丝样品，将其置于37℃恒温培养箱内培养48h，测定脱胶率，获得菌株的最优接种量。

1.2.7茧丝含水率的测定

准确称取1g茧丝，放入烘箱中105℃烘干至恒重，计算茧丝含水率：

1.2.9蛋白酶活力测定

碱性蛋白酶活力的测定按照Raval等[12]和Patel等[13]的方法进行。一个酶活力单位表示为1mL酶液在40℃、pH3.0的条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸定义为一个酶活力单位。

2结果与分析

2.1茧丝腐化液微生物群落结构分析

利用PCRDGGE技术对茧丝腐化液细菌微生物群落进行了研究，结果如图1所示。从图1可以看出，通过电泳获得多条清晰的条带。将优势度较高及光密度值较大的条带切胶回收、PCR扩增及克隆测序，测序结果与NCBI数据库中的基因序列进行比对，结果如表2所示。

细菌测序结果表明，共检出鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonadaceae）、芽孢杆菌属（Bacillus）和梭状菌属（Clostridium）3个属的细菌，其中优势菌属为芽孢杆菌属（Bacillus），共有11条谱带检测为芽孢杆菌属，丰度最高的菌为Bacillus sp.（Band 11）。而PCR图谱中优势度较高的5条谱带即谱带2、谱带3、谱带4、谱带7和谱带8，鉴定结果都为蜡样芽孢杆菌。分析结果表明，芽孢杆菌（Bacillus）为茧丝腐化液中的优势菌。杨雪霞等[14]利用可培养的方法对绢纺腐化液的微生物群落进行了分析，研究结果表明腐化液的主要微生物为细菌，浓度为1.34×107个/mL，研究中未检测到真菌和放线菌，原因可能是腐化液的pH值为6.5～7.0，不适合真菌及放线菌的生长。近年来，许多研究人员从茧丝腐化液中筛选出多株具有脱胶性能的细菌，多为芽孢杆菌属。Suwannaphan等[1]从茧丝脱胶废水中筛选获得一株产丝氨酸蛋白酶的脱胶菌株Bacillus sp.，该酶能完全除去丝胶。而且在长时间作用过程中不破坏丝心蛋白。单世宝等[5]从蚕丝腐化液中筛选获得一株具有脱胶功能的菌株，命名为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus D7，为建立蚕丝的纯种微生物发酵脱胶工艺奠定了基础。

2.2脱胶功能菌的筛选鉴定

以茧丝腐化液为研究对象，利用透明圈法从酪素琼脂培养基中挑取透明圈直径与菌落直径之比（D/d）较大的单菌落，共分离获得122株潜在的脱胶菌株。将菌株分别接种至脱胶培养基中进行进一步筛选，以脱胶率为基准，筛选获得脱胶率较高的菌株10株。将这10株菌株再接种至脱胶培养基中进行复筛，结果如表3所示。从表3可以看出，菌株TJ5脱胶率最高，达到18.6%左右。

菌株TJ5经活化后，提取基因组DNA，扩增获得其16S rDNA核苷酸序列，全长为1507 bp，在GenBank中登录号为MF465784，将该16S rDNA基因序列与NCBI中的DNA序列进行比对，得到10株有100%同源性的菌株，系统发育树中菌株TJ5（图2）与Aeromonassanarellii LMG 24682属于同一分枝，确定该菌株为气单胞菌属（Aeromonas），命名为Aeromonas sp. TJ5。

2.3功能菌脱胶条件的优化

传统的绢纺原料微生物脱胶通常采用自然发酵法，腐化液循环使用，能够快速启动发酵，缩短发酵周期，在采用微生物纯种培养脱胶时，需要对微生物脱胶的工艺条件进行优化。实验首先考察了培养基初始pH值对脱胶的影响，结果如图3（a）所示，培养基初始pH值对脱胶率有较大的影响，当初始pH值为6.0时，脱胶率为9.8%，增加pH值，脱胶率逐渐增加，在pH值为7.0时，脱胶率最高达到21.5%，继续增加pH值，脱胶率显著下降。因此，选择最适的初始pH值为7.0。微生物通常需要在一定的pH值环境中才能正常的生长、代谢和繁殖，如果pH值不合适，不但会妨碍微生物的正常生长繁殖，而且会改变微生物的代谢途径和代谢产物的性质。单世宝等[15]筛选了一株蚕丝脱胶菌，并对脱胶工艺进行了优化，结果表明，在pH值7.0时，蚕丝的残胶率最低，发酵液蛋白酶活力最高，分别达到5.23%和22.32U/mL。

图3（b）考察了温度对脱胶的影响，结果表明，升高温度脱胶率逐渐增加，当温度为37℃时，脱胶率最高，达到24.2%，继续增加温度，脱胶率显著降低。这主要由于温度影响细胞生长及酶的活性，研究结果与以前的报道一致[5]。

图3（c）考察了接种量对脱胶的影响，随着接种量的增加，茧丝脱胶率逐渐增加，当接种量为3%时，脱胶率最大，达到27.3%，继续增加接种量，脱胶率反而下降。单纯增加接种量并不能提高脱胶率，主要是由于营养物质的限制，使菌株的生长代谢受到影响，从而影响其代谢。因此，选择接种量为3%进行后续实验。

2.4菌株TJ5脱胶过程分析

在上述优化的发酵条件基础上，考察了发酵过程中菌株生长、脱胶率及蛋白酶活力的变化（图4）。从图4可见，随着发酵时间的延长，细胞生物量逐渐增加，在32h左右达到稳定；脱胶率和蛋白酶活力在发酵前期没有明显的变化，到对数期后，脱胶率和蛋白酶活力逐渐增加，可见蛋白酶的产生与丝胶的减少密切相关。结果显示，发酵48h，蛋白酶活力达到59.5U/mL，脱胶率达到28.2%。

3结论

茧丝腐化液是由多种微生物组成的混菌体系，微生物群落结构复杂，本文利用PCRDGGE技术对腐化液的微生物群落结构进行了解析，获得了茧丝腐化液的微生物群落组成；利用酪蛋白平板初筛和发酵脱胶复筛进行了脱胶功能菌的筛选，获得了一株能有效降低茧丝胶质的菌株TJ5，通过16S rDNA序列分析，对菌株进行了鉴定，命名为Aeromonas sp. TJ5。通过对菌株的微生物脱胶工艺进行优化，获得了最适的脱胶工艺条件，为茧丝的微生物纯种发酵脱胶奠定了基础。

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