姜黄素、甘草次酸和香菇多糖联合对CCl4诱导的建鲤肝损伤的保护作用

曹丽萍 杜金梁 贾睿 殷国俊 Galina Jeney 丁炜东 高崧

摘要：以四氯化碳（CC14）构建建鲤体内急性肝损伤模型，对姜黄素、甘草次酸和香菇多糖联合护肝作用进行研究。分别采用含有姜黄素、甘草次酸、香菇多糖和低、中、高剂量姜黄素+甘草次酸+香菇多糖联合中草药的饲料投喂60d后，各组建鲤腹腔注射30%CC14，注射剂量为每lg鱼体注射0.005ml，禁食72h，以诱导建鲤急性肝损伤。通过测定各组建鲤生长指标、血清和肝脏生化指标及肝组织炎性细胞因子mRNA的表达情况，观察姜黄素、甘草次酸和香菇多糖联合用药的保肝效果。结果显示：甘草次酸单味用药及中、高剂量姜黄素+甘草次酸+香菇多糖联合用药能显著提高建鲤的相对增重率和特定生长率，显著降低饵料系数;与模型组相比，各用药组能显著抑制CC14导致的血清中谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）和乳酸脱氢酶（LDH）活性的升高，显著恢复肝组织中谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）水平，抑制丙二醛（MDA）生成，能显著抑制C-Rel，iNOS、IL-Iβ、TNF-a、IL-6和IL-8表达量的升高;与姜黄素、甘草次酸或香菇多糖单味用药相比较，姜黄素+甘草次酸+香菇多糖联合用药的保肝效果更明显，随着联合用药剂量的升高，作用愈加显著。说明姜黄素、甘草次酸和香菇多糖联合用药，对CC14诱导的建鲤肝损伤具有协同保护作用。

关键词：建鲤;四氯化碳;肝损伤;中草药

中图分类号：S948

文献标识码：A

文章编号： 1000-4440（2018） 05-1100-07

中药姜黄为姜科姜黄属植物姜黄（Curcuma lon，-gaL.）的干燥根茎，现代药理学研究证明其具有广泛的药理作用。姜黄素（Curcumin）是中药姜黄的主要活性成分，是唯一一种具有酚基和醌基的天然药物，毒性低，耐受性好，具有较强的抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保肝及免疫调节等活性，且无明显的毒副作用，是常用传统中药。甘草次酸（Glycyr-thetinic acid，GA）是甘草的重要成分，具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、免疫调节、保肝等广泛的药理学作用。香菇多糖（Lentinan，LNT）是从担子菌纲香菇中提取的一种B-D-（1，3）葡萄糖残基为主链、（1，6）葡萄糖残基为侧链的葡聚糖，具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和促进干扰素生成等功能。

临床上，利用不同中药联合用药治疗疾病是中医用药的特色和优势。联合用药的优势一方面是中药基本性能发挥作用，另一方面是各个组成药物之间的协同放大作用。复方甘草酸苷联合水飞蓟素治疗药物性肝病的效果明显优于单味用药。五味子与黄芪多糖协同作用，能显著提高乙酰氨基酚致肝损伤小鼠谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平，降低谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）水平，减轻肝组织损伤程度。鉴于姜黄素、甘草次酸和香菇多糖的保肝和免疫调节功效，本研究以CC14诱导建鲤肝损伤，并建立急性肝损伤模型，通过检测建鲤生长指数、血清和肝脏组织匀浆中相关生化指标及细胞因子mRNA表达的变化，研究姜黄素、甘草次酸和香菇多糖联合用药对建鲤急性肝损伤的保护作用，探讨这3种中药配伍的合理性和科学性，为进一步开发鱼类保肝中草药配方奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验鱼

建鲤取自中国水产科学院淡水渔业研究中心渔场，体质健康无伤，规格基本一致，饲养于循环水系统中。驯养条件为：（27±2）℃，pH6.8～7.6，溶解氧（DO）质量浓度>5mg/L，NH3质量浓度<0.05mg/L，H2S质量浓度<0.01mg/L。每天投喂普通饲料（粗蛋白40%，粗脂肪10%，灰分10%，能量21kl/g）2次，每次投喂饲料量为鱼体质量的2%，驯养7d。

1.2 主要药品与仪器

姜黄素、甘草次酸购自Sigma公司，香菇多糖粗制粉购自无锡正大畜禽有限公司。CC14（分析纯）购于国药集团化学试剂有限公司，配置成30%的CC1。一橄榄油溶液（CC14：橄榄油=3：7，体积比）。谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）、乳酸脱氢酶（LDH）和超氧化物歧化酶（SOD）活性以及谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量测定试剂盒购自于南京建成生物工程研究所科技有限公司。DuGreen核酸染料（10000x水溶液）购自硕世生物科技有限公司，总RNA抽提试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒购自于TaKaRa公司。MK3酶标仪为Thermo公司产品，ABI-7500型PCR仪为美国ABI公司产品。

1.3 试验设计

初体质量为（30.0+1.0）g的健康鲤鱼，饲养于淡水渔业研究中心宜兴屺亭基地700cmx435cmX120cm的室内水泥池内。随机分为8组，每组20尾，分别为空白对照组、模型对照组（CC14）、姜黄素组（5.0g/kg姜黄素）、甘草次酸组（3.0g/kg甘草次酸）、香菇多糖组（3.0 g/kg香菇多糖）、联合药物低剂量组（1.0g/kg姜黄素+1.0g/kg甘草次酸+1.0g/kg香菇多糖）、联合药物中剂量组（2.5 g/kg姜黄素+1.5g/kg甘草次酸+1.5g/kg香菇多糖）和联合药物高剂量组（5.0g/kg姜黄素+3.Og/kg甘草次酸+3.0g/kg香菇多糖）。其中，空白对照和模型对照组均投喂普通饲料，其他各药物组分别投喂含相应剂量中药的饲料。每天投喂2次，每天记录投喂饵料量，每天投喂量约为鱼体质量的2%，共投喂60 d。投喂结束后，空白对照组腹腔注射橄榄油，模型对照组和各药物组腹腔注射30%的CC14，注射剂量为每10g鱼体注射0.05ml。禁食72 h，以诱导肝损伤。MS-222麻醉，各组称质量、采集血液和肝组织。

1.4 香菇多糖的制备及纯度测定

香菇多糖粗制粉的制备采用水煮醇沉法，略加修改。称取香菇多糖粗制粉100g加于100ml无菌水中，100℃水浴加热溶解30 min，待完全冷却后，350g、20℃离心10min，弃沉淀。上清液用無水分析乙醇沉淀至终浓度为80%，静置过夜。次日，用2层纱布滤出沉淀，并用无水乙醇洗涤沉淀2～3次。40℃烘箱中烘干沉淀，干燥后研磨过筛，备用。

采用Dubotls法绘制葡萄糖标准曲线并测定样品中多糖的含量。精密称取105℃干燥恒质量的葡萄糖10mg，置于100ml容量瓶中定容。准确吸取标准溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和1.0ml分置于试管中，各加蒸馏水使体积为2.0ml，再各加5%的苯酚1.0 ml，摇匀，滴加浓硫酸5.0ml，摇匀放置10min.置沸水浴中加热15 min.冷却，同时另取蒸馏水2.0ml，同上操作为空白对照。在490nm处测定吸光度，以浓度和吸光度为坐标绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程：Y=1.021 9+1.722 5x，R2=0.999。精密称取2mg香菇多糖提纯样品，溶解后按标准曲线绘制方法测定的吸光度值为2.638，以回归方程计算出样品中葡萄糖含量为93.82%。

1.5 生长指标的测定

饲养试验结束后，按照以下公式，计算每组鱼相对增质量率、特定生长率和饵料系数。相对增质量率（RWR）=（Wt- Wo）/Wo×100%，特定生长率（SGR]=（InW- In Wo）/￡xl00%，饵料系数（FCR）=F/（W- WO）×100%，其中，Wt为终体质量，Wo为初始体质量，t为投喂时间，F为投喂饲料量。

1.6 血清生化指标的测定

试验结束后，用一次性注射器采集鱼尾静脉血。各组血液样品4℃静置2h后，3000 r/min、4℃离心15min分离血清，-20℃保存，备用。按照试剂盒操作说明分别测定血清中谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）和乳酸脱氢酶（LDH）活性。

1.7 肝组织匀浆生化指标的测定

将抽完血的鱼进行解剖，在肝脏右中叶相同部位取肝脏组织，用预冷的生理盐水漂洗血液，剪去肝脏表面附着的结缔组织，再用滤纸吸去表面水分，称质量，用眼科剪刀剪碎，移人匀浆管中，加入9倍体积的生理盐水（体积分数为0. 86%）进行匀浆。该匀浆以2 000r/min离心15min，收集上清液，备用。按照试剂盒操作说明分别测定肝匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）含量和丙二醛（MDA）含量。

1.8 肝组织中NF-kB /C-Rel、iNOS、IL-lβ、TNF-α、IL-6和IL-8mRNA的表达水平测定

鲤鱼处死后，剖取适量肝组织，参照RNAiso Re-agent说明书提取总RNA。采用紫外分光光度计测定RNA的浓度及纯度，以OD260/OD280值达到1.8～2.0作为合格标准。以Oligo（dT）18为引物进行RT反应，合成cDNA。实时荧光定量PCR反应按照TaKaRa公司生产的ExScript TM RT-PCR Kit（Per-fect Real Time：SYBR Green I）说明书进行。基因特异引物及内参β-actin，引物分别按照鲤NF-kB/C-Rel、iNOS、IL一1β、TNF-a、//-6、//-8和p-actin，基因序列采用Primer Primer 5.0软件设计（表1）。

1.9 数据分析

试验数据用平均值±标准差表示，数据分析采用SPSS15软件包中的单因素方差分析（one-way-ANOVA）。

2 结果

2.1 姜黄素、甘草次酸和香菇多糖对肝损伤建鲤生长指标的影响

60 d的试验结果（表2）显示：与对照相比，甘草次酸单味用药及中、高剂量姜黄素+甘草次酸+香菇多糖联合用药能显著提高建鲤的相对增质量率和特定生长率（P<0.05），显著降低饵料系数（P<0.05），姜黄素、香菇多糖单味用药及低剂量联合用药的效果不明显（P>0.05）：与姜黄素、甘草次酸或香菇多糖单味用药相比较，姜黄素+甘草次酸+香菇多糖联合用药对这3个生长指标有显著作用（P<0.05），随着联合用药组剂量的升高，效果愈加明显。

2.2 姜黄素、甘草次酸和香菇多糖对肝损伤建鲤生化指标的影响

图1显示：30% CCI4-橄榄油腹腔注射建鲤后72 h，血清中GOT、GPT和LDH活性均显著性高于空白对照组（P<0.05）;各个用药组与CC14对照组相比较，血清中GOT、GPT和IDH活性均显著下降（P<0.05）;与姜黄素、甘草次酸或香菇多糖单味用药组相比较，姜黄素+甘草次酸+香菇多糖联合用药对恢复血清中的GOT、GPT和LDH活性有显著作用（P<0.05），随着联合用药剂量的升高，协同作用愈加明显。

从图2可见.30% CC14一橄榄油腹腔注射建鲤后72 h.肝组织匀浆中GSH含量和SOD活性均显著低于空白对照（P<0.05），MDA含量显著升高（P<0.05）;与CC14对照相比，姜黄素、甘草次酸、联合用药均能显著促进组织中SOD活性及GSH含量水平恢复（P<0.05），显著抑制MDA生成（P<0.05），其中，香菇多糖组能显著提高GSH水平，抑制MDA生成（P<0.05），但对SOD活性恢复没有明显作用（P>0.05）;与姜黄素、甘草次酸或香菇多糖单味用药相比较，姜黄素+甘草次酸+香菇多糖联合用药对恢复肝组织中SOD活性和GSH水平及降低MDA含量有显著作用（P<0.05），随着联合用药剂量的升高，作用愈加显著。

2.3 姜黄素、甘草次酸和香菇多糖对建鲤肝组织中炎性细胞因子表达的影响

为了考察中药联合用药对建鲤肝组织中炎性细胞因子表达的影响，应用实时定量PCR方法测定了NF-kB/C-Rel、iNOS、IL—lβ、TNF-a、IL-6和IL-8 mR-NA相对含量。结果（图3）显示，30%CC14一橄榄油腹腔注射建鲤后72 h，肝组织中炎性细胞因子的mRNA表达量与空白对照相比，均显著升高（P<0.05）;与CC14对照组相比，姜黄素、甘草次酸、联合用药均能显著抑制NF-kB/C-Rel、iNOS、IL一1β、TNF-α、IL-6和//-8表达量的升高（P<0.05）;与姜黄素、甘草次酸或香菇多糖單味用药相比较，姜黄素+甘草次酸+香菇多糖联合用药对恢复肝组织中炎性细胞因子的mRNA水平有显著作用（P<0.05），随着联合用药剂量的升高，作用愈加显著。

3 讨论

CC14诱导建鲤肝组织损伤后，中间代谢产物过氧化三氯甲烷自由基（ CC1302·）通过攻击肝细胞膜上磷脂分子引起脂质过氧化，损伤肝细胞，导致肝组织中的生化指标发生变化。GPT、GOT和LDH是主要功能酶，肝细胞受损或坏死时，这些酶会进入血液，使血清中酶水平显著提高。同时脂质过氧化会导致SOD活性、GSH含量下降，MDA含量增加。本研究中采用30% CCI4-橄榄油腹腔注射建鲤后，发现姜黄素、甘草次酸、香菇多糖单味用药及联合用药均可以降低CC14诱导的建鲤血清中酶活性和肝组织中MDA含量，恢复肝组织中SOD和GSH水平，说明姜黄素、甘草次酸和香菇多糖不管是单独使用还是联合用药均有保护肝组织的作用。研究结果还表明，姜黄素+甘草次酸+香菇多糖联合用药与3种中药单独使用相比较，降低肝损伤的作用更显著，且具有剂量依懒性，说明三者联合使用具有协同保护作用。

另一方面，CC1302·可激活核转录因子NF-KB，导致炎细胞大量释放炎性介质（例如细胞因子IL一1β、TNF-a、IL-6及IL-8等），介质进一步活化中性粒细胞等炎细胞，通过级联反应而导致肝细胞变性死亡¨18-19]。抑制有关细胞因子的表达，可以有效降低肝损伤。本研究结果显示，30% CCI4一橄榄油腹腔注射建鲤后，肝组织中NF-KB/C-Rel、iNOS、IL一1β、TNF-a、IL-6和IL-8 mRNA表达量显著增加，而姜黄素、甘草次酸和香菇多糖均能抑制相关因子的表达上调，而联合用药的效果更为显著，表明姜黄素、甘草次酸和香菇多糖能通過抑制NF-KB/C-Rel的活化以及下调炎症细胞因子的表达来降低CC14诱导的肝损伤，具有肝保护作用，3种药联合使用对抑制细胞因子表达具有协同作用。

临床上，甘草被广泛应用于中药复方配伍里，甘草对增加溶解性，提高有效成分利用率，增强药效和降低毒性有显著作用。甘草次酸作为甘草的主要有效成分之一，也表现出与甘草类似的调和性质。常明向等发现相较于姜黄素或甘草次酸单独用药，两者联合用药药效呈现相加或增强作用。周京辉等也发现，甘草次酸能加强姜黄素对HepG-2、MCF-7、A549癌细胞增殖的抑制作用，而且两者在癌细胞的增殖抑制方面表现出协同作用。这些发现与本研究结果具有一致性，姜黄素、甘草次酸和香菇多糖联合用药对CC14诱导的建鲤肝损伤具有协同保护作用，这除了与它们自身的药性作用有关外，可能还与甘草次酸的调和特性及香菇多糖能提高机体免疫力的作用有关，这也表明姜黄素、甘草次酸和香菇多糖联合用药的合理性和科学性。