从白星花金龟中提取甲壳素的工艺研究

李小万　王萍莉

摘要目的：探讨从白星花金龟中提取甲壳素的最佳制备工艺。方法：选取白星花金龟的成虫为原料，采用强酸强碱对成虫粉进行脱除无机盐和蛋白质处理，再脱色后得到甲壳素，用干法灰分法和紫外吸收法分别测定提取物中残余的无机盐和蛋白质。结果：用15 g/L柠檬酸溶液在室温下按料液比1∶10浸泡白星花金龟成虫粉26 h，脱无机盐效果较好；用10%氢氧化钠溶液按料液比为1∶10在80 ℃水浴条件下处理提取物45 h，脱蛋白质的效果较好；用10%H2O2溶液按料液比为1∶12在60 ℃水浴浸泡3 h脱色，可制得白色粉状甲壳素，得率为283%。结论：该提取工艺简便可行，获得的甲壳素得率高，性状良好，残余蛋白质和灰分含量较低。

关键词白星花金龟；甲壳素；脱除无机盐；脱除；蛋白质

Study on the Extraction of Chitin from Protaetia Brevitarsis Lewis

Li Xiaowan， Wang Pingli

（Xinjiang Agricultural Vocational and Technical College Biological Technology Branch， Changji 831100， China）

AbstractObjective：To study the best preparation process of chitin extraction from protaetia brevitarsis， Lewis. Methods：The adult larvae of the white star flower are used as raw materials， and the adult powder and protein are removed by strong acids and alkalis. The chitin is obtained after decolorization. The residual inorganic salts and protein in the extract are determined by dry ash method and ultraviolet absorption method. Results：15 g/L citric acid solution was used to soak adult protaetia brevitarsis， Lewis powder at a ratio of 1∶10 at room temperature for 26 h， and the effect of removing inorganic salts was better； 10% NaOH solution was used to the ratio of material to liquid was 1∶10， and the extract was processed at 80 ℃ water bath for 45 h. The effect of deproteinization was better. The white powdery chitin was obtained by using 10% H2O2 solution at a ratio of 1∶12 in a water bath at 60 ℃ for 3 h. The yield rate was 283%. Conclusion：The extraction process is simple and feasible， and the obtained chitin has high yield， good traits and low residual protein and ash content.

Key WordsProtaetia brevitarsis Lewis； Chitin； Removal of inorganic salts； Removal of protein

中圖分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.049

甲壳素又称甲壳质、几丁质，属于氨基多糖，被誉为“人类第六生命要素”，是自然界中一种带正电荷的天然高分子材料，因具有良好的吸湿性、生物降解性、无不良反应以及不污染环境等诸多优良特性，近几年被广泛应用在环保工业、纺织工业、医药保健行业、食品工业、农林业等方面[15]。

甲壳素广泛存在于低等植物菌类、藻类的细胞，节肢动物虾、蟹、蝇蛆和昆虫的外壳，高等植物的细胞壁中[6]。因来源不同，其甲壳素的含量也不同。据报道：虾壳中含量为20%～25%，蟹壳中的含量为15%～18%，昆虫原表皮层中的含量为25%～60%[7]等。

目前市场上的甲壳素获得主要是以虾壳和蟹壳为原料来提取制备。以虾蟹为原料，资源成本高，且甲壳素含量低、灰分含量高，提取物中的重金属难以脱除，同时其生产受到地域性和季节性的限制较大[811]，因此，寻找及开发新的甲壳素资源具有重要意义。据报道，白星花金龟虫体中甲壳素含量达233%[12]。因其作为害虫在农田中分布广泛[13]，比较容易获得，且相关的研究报道较少，故我们以白星花金龟为研究对象，主要研究从其成虫体中提取甲壳素的一种酸碱法的优化工艺，旨在为获取新的甲壳素资源提供参考。

1材料

11试药

白星花金龟成虫：采自新疆昌吉市周边乡镇；柠檬酸：食品级，郑州中天实验仪器有限公司，生产批号：160508；氢氧化钠：分析纯，上海恒远生物科技有限公司，生产批号：160316；过氧化氢，草酸，高锰酸钾，乙醇，碘碘化钾，浓硫酸，以上试剂均为分析纯。

12仪器

LD800型实验室超微粉碎机，长沙常宏制药设备厂；DK98I型恒温水浴锅，泰斯特仪器有限公司；1012型电热恒温鼓风干燥箱，北京市永光明医疗仪器厂；SXL1208马沸炉，上海精宏干燥箱厂；UV2450型紫外分光光度计，日本岛津公司；BS2000S型电子天平，北京赛多利斯仪器厂等。

2方法

21工艺流程

白星花金龟成虫→预处理（闷死、清洗、烘干、粉碎）→脱无机盐→水洗至中性→脱蛋白质→水洗至中性→脱色→烘干→甲壳素。

22指标分析检测

221定性分析1）显色反应：取少量提取物倒入小培养皿中，并用镊子将其依次移人含量为95%、70%、50%、30%乙醇溶液中清洗，再用蒸馏水冲洗待用；将甲壳素置于自瓷点滴试验板上，加入1滴003%碘碘化钾溶液，再加1滴1%H2SO4在点滴试样板上，显示紫褐色，再加数滴75%H2SO4紫色逐渐消失，表明测定物为甲壳素。2）α一萘酚实验：取少量提取物溶于水中，然后再加98%浓硫酸，振摇，在糖溶液与浓硫酸两液面间出现了红紫色的环（紫环反应），表明了该提取物为甲壳素[14]。

222定量分析1）灰分测定：采用干法灰分法，按以下公式计算各实验组的的灰分含量，以确定脱除无机盐最佳试验条件；总灰分（%）=（恒重后坩埚和灰分质量-恒重后坩埚质量）/样品质量×100[15]；2）残余蛋白质含量测定：采用紫外吸收法，采用以下公式计算各实验组的蛋白质含量，以确定脱除蛋白质的最佳试验条件。蛋白质含量（μg/mL）=（145A280-074A260）×稀释倍数，式中：A280、A260分别为蛋白质溶液在280 nm、260 nm处测得的吸光度[16]。

23预处理

231闷死挑選大小一致的白星花金龟成虫，装入塑料薄膜袋内密封至闷死不动。

232清洗用水反复冲洗至表面无明显污渍，沥干。

233烘干放入恒温鼓风干燥箱中，于75 ℃烘至白星花金龟虫体硬脆。

234粉碎用小型粉碎机粉碎，过20目筛，得白星花金龟虫粉，装袋密封备用。

24脱无机盐

241柠檬酸浓度对脱无机盐效果的影响称取5份白星花金龟虫粉，5 g/份，分别置于100 mL三角瓶中，按1∶10（g/mL）的固液比分别加入浓度为09、12、15、18、21（g/L）柠檬酸溶液，在室温条件下反应26 h后，离心并将固体产物水洗至中性，干燥后得脱无机盐的各组样品，分别测定各组样品灰分，以确定柠檬酸的最适浓度。

242柠檬酸作用时间对脱无机盐效果的影响称取5份白星花金龟虫粉，5 g/份，分别置于100 mL三角瓶中，在柠檬酸浓度15 g/L、固液比1∶10（g/mL）、室温条件下，分别作用18 h、22 h、26 h、30 h、34 h后，离心并将固体产物水洗至中性，干燥后得脱无机盐的各组样品，分别测定各组样品灰分，以确定柠檬酸作用的最适时间。

243柠檬酸酸浸料液比对脱无机盐效果的影响称取5份白星花金龟虫粉，5 g/份，分别置于100 mL三角瓶中，在柠檬酸浓度15 g/L、室温条件下，分别按固液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（g/mL）加入柠檬酸溶液，反应时间26 h，离心并将固体产物水洗至中性，干燥得脱无机盐的各组样品，分别测定各组样品灰分，以确定柠檬酸的最适固液比。

25脱蛋白质处理

251氢氧化钠浓度对脱蛋白质效果的影响取脱无机盐最佳条件下所得的滤渣5份，分别置于250 mL三角瓶中，按固液比1∶10（g/mL），分别加入6%、8%、10%、12%、14%氢氧化钠溶液，在80 ℃水浴锅中作用5 h，离心并将固体产物水洗至中性，干燥得脱蛋白质的各组样品，分别测定各组样品残余蛋白质含量，以确定氢氧化钠的最适浓度。

252氢氧化钠作用时间对脱蛋白质效果的影响取脱无机盐最佳条件下所得的滤渣5份，分别置于250 mL三角瓶中，在固液比1∶10（g/mL）、氢氧化钠浓度10%的条件下，在80 ℃水浴锅中分别作用1 h、3 h、5 h、7 h、9 h，离心并将固体产物水洗至中性，干燥得脱蛋白质的各组样品，分别测定各组样品残余蛋白质含量，以确定氢氧化钠作用的最适时间。

253氢氧化钠碱浸温度对脱蛋白质效果的影响取脱无机盐最佳条件下所得的滤渣5份，分别置于250 mL三角瓶中，在固液比1∶10（g/mL）、氢氧化钠浓度10%条件下，分别置于60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴锅中，恒温作用5 h，离心并将固体产物水洗至中性，干燥得脱蛋白质的各组样品，分别测定各组样品残余蛋白质含量，以确定氢氧化钠作用的最适温度。

254氢氧化钠碱浸固液比的确定取脱无机盐最佳条件下所得的滤渣5份，分别置于250 mL三角瓶中，按固液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（g/mL）分别加入10%氢氧化钠溶液，在90 ℃水浴锅中恒温作用5 h，离心并将固体产物水洗至中性，干燥得脱蛋白质的各组样品，分别测定各组样品残余蛋白质含量，以确定氢氧化钠作用的最适固液比。

26脱色处理

取脱无机盐和脱蛋白质最佳条件处理后的样品3份，以料液比1∶12（g/mL），分别加入3%高锰酸钾、3%草酸和10%H2O2，在60 ℃水浴浸泡3 h，水洗，于110 ℃烘箱烘干，观察甲壳素的性状[17]。

27甲壳素的质量

取白星花金龟成虫按以上的最佳实验条件进行甲壳素提取，并对提取物进行定性和定量分析。

3结果

31脱无机盐处理

311柠檬酸浓度对脱无机盐效果的影响

样品中灰分含量随着柠檬酸浓度的增加，总体呈下降趋势。但当柠檬酸浓度小于15 g/L，曲线下降较快，当柠檬酸浓度大于15 g/L时，曲线趋于平缓，所以脱无机盐效果最佳的柠檬酸浓度为15 g/L。见图1。

312柠檬酸作用时间对脱除无机盐效果的影响

随着柠檬酸作用时间的延长，灰分含量呈下降趋势，在反应的最初阶段，曲线下降较快，当反应时间达到26 h以后其灰分含量的下降趋势明显减缓。26 h为脱除无机盐效果最佳的柠檬酸作用时间。见图2。

313酸浸料液比对脱除无机盐效果的影响当固液比由1∶6（g/mL）变至1∶10（g/mL）时，灰分含量下降趋势较为明显，而当固液比由1∶10（g/mL）变至1∶14（g/mL）时，曲线下降趋势不明显。1∶10（g/mL）为脱除无机盐效果最佳的酸浸料液比。见图3。

32脱蛋白质处理

321氢氧化钠浓度对脱蛋白质效果的影响当氢氧化钠浓度由6%增至10%时，残余蛋白质的含量下降较明显，但当氢氧化钠浓度大于10%时，残余蛋白质含量下降的趋势平缓，对脱除蛋白质的影响效果不是很大。10%为脱蛋白质效果最佳的氢氧化钠浓度。见图4。

322氢氧化钠作用时间对脱蛋白质效果的影响随着氢氧化钠的作用时间的延长，残余蛋白质含量下降较快，但当氢氧化钠浸泡时间超过45 h时，曲线趋于平缓，45 h是脱蛋白质效果最佳的氢氧化钠作用时间。见图5。

323氢氧化钠碱浸温度对脱蛋白质效果的影响氢氧化钠碱煮的温度越高，脱除蛋白效果越明显，但当达到80 ℃以后，残余蛋白质含量下降的趋势减缓。80 ℃是脱除蛋白质效果最佳的氢氧化钠碱煮温度。见图6。

324氢氧化钠碱浸固液比对脱蛋白质效果的影响当固液比1∶6（g/mL）变至1∶10（g/mL）时，曲线下降较快，说明脱除蛋白质的效果明显；但当固液比超过1∶10（g/mL）以上时，曲线平缓，说明对除蛋白的效果不明显，因此，确定1∶10（g/mL）为脱除蛋白质的效果最佳的碱浸固液比。见图7。

33脱色处理

通过3种脱色剂的相同条件处理，只有10%过氧化氢脱色所得的甲壳素颜色最纯，所以10%过氧化氢为最佳脱色剂。见表1。

34甲殼素的质量

341定性分析结果均呈阳性，表明所获提取物为甲壳素。

342从白星花金龟成虫中获得的甲壳素收率较高，且残余蛋白质和灰分较低。其中残余灰分为125%，低于2%。见表2。

4讨论

在借鉴前人研究成果的基础上，经过预试验筛选，选择了柠檬酸、氢氧化钠、过氧化氢等试剂对白星花金龟进行脱无机盐、脱蛋白质、脱色处理，以测定提取物中残余的灰分含量、残余的蛋白质含量、观察甲壳素的性状为质量指标，最终确定了从白星花金龟成虫中提取甲壳素的最佳工艺条件为：在白星花金龟虫粉中以1∶10的料液比，加入15 g/L柠檬酸溶液在室温下浸泡26 h，进行脱无机盐处理；再以1∶10的料液比，加入10%NaOH溶液在80 ℃水浴条件下处理45 h，进行脱蛋白质处理；再以1∶12的料液比，加入10%H2O2溶液在60 ℃水浴浸泡3 h，水洗，烘干后得到了白色粉状甲壳素，得率为283%。可以替代虾蟹壳作为新的甲壳素提取原料。

在本研究的预试验中，分别以白星花金龟的4种不同虫态（成虫，幼虫，蛹，成虫鞘翅）作为原料，经过提取分析后，发现白星花金龟成虫中的甲壳素得率最高，其次是成虫鞘翅、再次是蛹、最后是幼虫。这说明甲壳素含量多少与昆虫体壁的角质化程度大小相关。因为甲壳素主要存在于昆虫的体壁的表皮层部分，所以在提取时应选择体壁中角质化较高且大小均一的白星花金龟作为原料。

甲壳素的定性分析应该用红外光谱法，但因为试验仪器故障问题，本试验选用了传统的显色反应来鉴别，结果的准确性受到一定的影响，在后续研究中需改进。

灰分含量是衡量甲壳素质量的主要指标之一，本试验中所获甲壳素中残余灰分虽然降到了2%以下，但只达到了工业级的甲壳素标准[18]，而未达到食品级的甲壳素标准（<1%）。原因可能与用柠檬酸代替了盐酸作为除无机盐的试剂有关。

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（2016-10-09收稿责任编辑：杨觉雄）