3种蓝细菌藻蓝蛋白β亚基脱辅基蛋白基因的克隆、表达及重组蛋白的抗氧化活性

伍贤军 杨红 盛怡 冷倩男 李萍萍

摘要： 为研究蓝细菌藻蓝蛋白脱辅基蛋白的抗氧化活性，分别从3种蓝细菌Spirulina subsalsa、Mastigocladuslarmnosus和Nostoc PCC 7120中克隆C一藻蓝蛋白β亚基编码基因cpc Bsp、cpcBMa和cpcBNo，在大肠杆菌中表达，获得了重组蛋白CpcBsp、Cpc BMa和CpcBNo。通过测定其对羟基自由基和DPPH自由基的清除率，比较它们的抗氧化活性。结果显示：3种重组蛋白对羟基自由基和DPPH自由基的清除率都随着蛋白质质量浓度的增加而升高。当蛋白质浓度达到250 mg/L时，CpcBsp、CpcBMa和CpcBNo对羟基自由基的清除率分别为82%、89%和93%，对DPPH自由基的清除率分别为43010、49010和58010。以上结果表明，3种重组藻蓝蛋白脱辅基蛋白都具有较高的抗氧化活性，有潜力作为医疗上使用的抗氧化试剂，不同蓝细菌的同源藻蓝蛋白的抗氧化能力存在一定差异，选择不同蓝细菌的藻蓝蛋白是提高重组藻蓝蛋白抗氧化能力的有效途径，

关键词：藻蓝蛋白;抗氧化活性;重组蛋白;自由基

中图分类号：TS202.3

文献标识码：A

文章编号： 1000-4440（2018） 05-0998-07

藻蓝蛋白（Phycocyanin，PC）是某些藻类中结合四吡咯色素分子，具有蓝色的捕光色素蛋白复合物，C-藻蓝蛋白（C-PC）是其主要的类型。C-PC由α和β亚基组成，在天然条件下，通常以（αβ）、（αβ）3或（αβ）6等多聚体的形式存在。藻蓝蛋白亚基由藻蓝色素和相应的脱辅基蛋白共价偶联而成。C-PC具有良好的生物相容性、无毒性、水溶性、独特的颜色以及在可见光区强烈的吸收和荧光，所以广泛使用在食品、化妆品、生物技术和生物医药等领域。C-PC展现强烈的抗氧化效应，比如对过氧化氢自由基、烷基自由基和羟基自由基的清除活性。同时C-PC也有抗炎症、抗病菌、抗癌细胞以及保护神经的医疗效用。由于大多数病理特征伴随着活性氧自由基（ROS）的产生，所以，这些医疗特性也和C-PC的抗氧化性密切相关。

C-PC 一般从天然的藻类中直接提取，也能在大肠杆菌中重组产生。研究结果表明，重组C-PC比天然的C-PC具有更强的抗氧化能力。C-PC的抗氧化机理最初主要认为仅是色素的抗氧化性，通过克隆藻蓝蛋白的编码基因，在大肠杆菌中表达藻蓝蛋白脱辅基蛋白，验证了脱辅基蛋白也具有抗氧化活性。这表明C-PC的抗氧化性不仅有色素的作用，还包括脱辅基蛋白的贡献。色素蛋白的生物合成过程复杂且不稳定，不仅需要藻蓝蛋白脱辅基蛋白，还需要与血红素氧化酶、色素还原酶以及裂合酶共表达，而仅用藻蓝蛋白脱辅基蛋白则更为简单可靠。

尽管藻蓝蛋白脱辅基蛋白具有抗氧化特征，但其抗氧化机制尚不清楚。不同藻类藻蓝蛋白的蛋白质结构和氨基酸组成存在一定的差异，这些差异可能会影响其抗氧化能力。本研究从螺旋藻Spirulinasubsatsa、层理鞭枝藻Mastigocladus laminosus和鱼腥藻Nostoc PCC 7120中克隆藻蓝蛋白β亚基CpcBsP、CpcBMa和CpcBNo的编码基因，分别在大肠杆菌中表达，产生重组蛋白，并通过测定重组蛋白对DPPH自由基和羟基自由基的清除能力评估不同蓝细菌重组蛋白的抗氧化活性，为研究藻蓝蛋白的抗氧化性机理提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

螺旋藻Spirulina subsalsa、层理鞭枝藻Mastigo-cladus laminosus和鱼腥藻Nostoc PCC 7120购自中国科学院水生生物研究所，克隆载体pUC19购自TaKaRa公司，表达载体pETDuet-l购自Novagen公司。表达宿主菌Escherichia coli BL21（DE3）为本实验室提供。

限制性内切酶、T4 DNA连接酶、BCA蛋白质定量分析试剂盒购自美国Thermo公司，DNA marker、蛋白质Marker购自安诺伦（北京）生物科技有限公司，质粒小提试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、Taq酶、dNTP和其他PCR试剂均购自天根（北京）生物科技有限公司，IPTG（异丙基β-D-硫代半乳糖苷）购自博奥拓达（北京）科技有限公司，蛋白胨（Tryp-tone）和酵母粉（Yeast Extract）为英国OXOID公司产品，氨苄西林为韩国Biosharp公司产品，其他常规试剂均为国产分析纯。引物合成和基因测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 仪器与设备

Labcycler PCR仪，德国SensoQuest公司产品;Lambda 365紫外/可见分光光度计，美国Perkin El-mer公司产品：LS55荧光分光光度计，美国PerkinElmer公司产品：MIKR0 200R小型微量冷冻离心机，德国Hettich公司產品：GenoSens1850凝胶成像系统，上海勤翔科技有限公司产品;恒温混匀器，美国Grant公司产品：JY96-ⅡN超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品;Bio-Rad蛋白质电泳仪，美国伯乐公司产品：DNA电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品。

1.3 蓝细菌的培养和基因组DNA的提取

参照文献、的方法培养蓝细菌Spiruli-na subsalsa、Mastigocladus lamin，osus和Nostoc PCC7120。

蓝细菌基因组DNA的提取参照朱万鹏的方法。离心收集的蓝细菌重悬于TE（pH8.0）缓冲液中，向重悬的菌液中加入适量十二烷基硫酸钠（SDS）和石英砂，在振荡器上振荡，尽量使细胞全部破碎。用酚/氯仿/异戊醇（体积比25∶24∶1）的混合液抽提2次，离心取上清液，再用氯仿抽提1次，离心取上清液，加入2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min，离心沉淀DNA.溶于20μl TE缓冲液备用。

1.4 引物设计及PCR扩增

根据NCBI数据库中Nostoc PCC 7120 C-藻蓝蛋白编码基因cpcBNo（GenBanK登录号：NC_003272）、Mastigocladus laminosus C-藻蓝蛋白编码基因cpcBMa（GenBanK登录号：WP-009454964）和Spirulinasubsalsa C-藻蓝蛋白编码基因cpcBSp（GenBank登录号：AY804216）的DNA序列设计引物，引物序列见表l。PCR条件：94℃预变性3 min; 94℃变性30s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环：最终72 cC延伸5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认后，送至金斯瑞基因公司测序。

1.5 表达载体的构建及转化

为了构建表达载体，鉴定后的PCR产物用限制性内切酶Sac I和Hind III双酶切，插入经过同样双酶切的空载体pETDuet-l，用CaCl，法转化到已经制备好的感受态细胞Escherichia coli DH5a.涂布在加有氨苄抗生素的LB固体培养基上，置于恒温培养箱37℃过夜倒置培养16 h，挑取单菌落于5 ml LB液体培养基，37℃、250 r/min振荡8h，小量提取重组质粒，用Sac I和Hind III双酶切质粒，进行琼脂糖凝胶电泳验证。重组质粒用CaCl，法转入表达宿主菌Escherichia coli BL21（DE3）中，获得含重组质粒的重组菌株，并用50%的甘油与菌液以体积比为1∶2的比例混匀，-20℃保存备用。

1.6 目的蛋白的表达、纯化及SDS·PAGE电泳

将重组菌株接种到5 ml含100 mg/L氨苄抗生素的LB液体培养基中，置于恒温摇床37℃、250r/min培养10 h.接种3 ml浓菌液到300 ml液体LB培养基中，37℃、250 r/min继续培养，直到OD600为0.4～0.5左右，冰浴30 min.加入终浓度为1 mmol/L的诱导剂IPTG置于摇床诱导表达，摇床转速为150r/min，表达温度为20℃，表达时间为12 h。用台式离心机6500 r/min收集表达后的细胞，用去离子水清洗3遍，加入磷酸盐缓冲液（50 mmol/L KH2PO4-K2HP04+500 mmol/L NaCl，pH 7.2）充分悬浮细胞，取少量的细胞制备样品，进行SDS-PAGE蛋白质电泳，对重组蛋白进行分析和鉴定。其余通过超声破碎仪裂解破碎（400 W，超声5s，间歇10 s，共超声15 min），裂解液4℃、12 000 r/min离心30 min，收集包含可溶性目的蛋白的上清液。

由于表达载体的N端融合了组氨酸His标签，故可以利用镍离子亲和层析柱（GE Healthcare）进行蛋白质的纯化。结合镍离子的亲和层析胶用Startbuffer平衡液处理后，加入收集到的上清液，用10倍的StaIt buffer平衡液冲洗，再用2倍体积包含50mmol/L咪唑的Start buffer进行冲洗，最后用包含500 mmol/L咪唑的Start buffer收集重组蛋白溶液。蛋白质溶液装入透析袋，置于透析缓冲液（50mmol/L KPB缓冲液，500 mmol/L NaCl，pH 7.2）中透析8—12 h以充分去除咪唑，透析期间更换透析液。使用BCA蛋白定量分析试剂盒按照标准方法测定蛋白质浓度。取少量蛋白质制备样品，进行SDS-PAGE电泳，对重组蛋白进行分析和鉴定。

1.7 羟基自由基清除率测定

利用稍作修改后的脱氧核糖法评估蛋白质对羟基自由基的清除能力。方法如下：配制包含20mmol/L KPB缓冲液（KH2P04-K2HP04，pH7.2）、2.8mmol/L脱氧核糖、1mmol/L双氧水、100μmol/L EDTA的反应液，往反应液中加入样品，使样品在反应液中的终浓度分别为50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml，往反应液中加入终浓度为100μmol/L的抗坏血酸和100μmol/L三氯化铁（FeCl3）以启动反应，总体积为500μl的反应体系置于37 cC中保持30 min，加入250μl三氯乙酸（质量浓度为2.8%，溶于去离子水）终止反应，加入250μl硫代巴比妥酸（TBA，质量浓度为1%，溶于50 mmol/L NaOH），煮沸15 min进行显色反应，1 ml反应液冷却后用20mmol/LKPB缓冲液稀释2倍（pH 7.2），测定532 nm处的吸光度。阳性对照甘露醇和蛋白质样品的吸光度为A1，空白对照20 mmol/L KPB缓冲液吸光度为Ao，则羟基自由基的清除活性计算公式为：羟基自由基清除活性=[（Ao-A1）/Ao] xl00%。

1.8 DPPH自由基清除率测定

参照Ping等的方法进行DPPH自由基清除试验，稍作修改。加入1ml终浓度分别为50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml的重组蛋白样品到2 ml含有6.5×10-5mol/LDPPH的甲醇溶液中，混匀.25℃避光静置30 min，测定517nm处的吸光度。DPPH自由基清除率計算公式：清除率=[（A0-A1+A2）/A0] xl00%，式中，Ao为未加样品的吸光度，A1为样品吸光度，A2为空白（未加DPPH）吸光度。用抗坏血酸Vc作为参照。

1.9 数据分析

所有试验均进行3次重复，取平均值。应用SPSS 22.0统计软件进行分析，采用Origin 9.1软件作图。

2 结果与分析

2.1 3种蓝细菌藻蓝蛋白β亚基的同源性

利用CLUSTALW（2.1）软件将3种蓝细菌Spir-ulina subsalsa、Mastigocladus lamirzosus和Nostoc PCC7120的C-藻蓝蛋白β亚基（CpcBsp、CpcBMa和CpcBN0）氨基酸序列进行同源性比较。结果（图1）显示，3种C-藻蓝蛋白β亚基的氨基酸序列同源性为79%。其中，CpcBsp和CpcBMa的同源性为84%，CpcBsp和CpcBNo的同源性为85%，CpcBMa和CpcBN0的同源性为90%。它们之间表现出较高的同源性，但也具有一定的差异。

2.2 藻蓝蛋白β亚基编码基因PCR扩增产物鉴定

提取蓝藻Spirulina subsalsa、Mastigocladus lamin-OSus和Nostoc PCC 7120的基因组DNA。以NostocPCC 7120基因组DNA为模板，Pl和P2为引物进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳后获得500 bp左右的DNA条带（图2），PCR产物测序结果显示其碱基序列与已报道的Nostoc PCC 7120中的cpcB完全一致，命名为cpcBNo;以Mastigocladus laminosus基因组DNA为模板，P3和P4为引物进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳后获得500 bp左右的DNA条带，PCR产物碱基序列与已报道的Mastigocladus lamin-osus中的cpcB完全一致，命名为cpcBMa;以Spirulinasubsalsa基因组DNA为模板，P5和P6为引物进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳后获得500 bp左右的DNA条带，PCR产物测序结果显示其大小为519 bp，与目的基因大小一致，命名为cpcBsp，其基因碱基序列与已报道的Spirulina subsalsa中cpcB的相似度为90%，翻译后的氨基酸序列相似度为95%，跨度为100%。

2.3 重组质粒pETDuet-cpcBNo、pETDuet-cpcBMa和pETDuet-cpcBSp的构建

将扩增得到的目的基因cpcBNo、cpcBMa、cpcBSp和表达载体pETDuet-l分别进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化并回收酶切产物，过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，置于恒温培养箱中过夜培养，挑取单克隆菌落，提取重组质粒pETDuet-cpcBNo、pETDuet-cpcBMa和pETDuet-cpcBsp。新质粒分别用Sac I和Hind III双酶切。琼脂糖凝胶电泳检测结果（图3）显示，在500 bp左右处观察到DNA条带，与预测的目的基因大小一致，表明重组质粒构建成功。

2.4 重组藻蓝蛋白的表达和纯化

将重组质粒pETDuet-cpcBNo、pETDuet-cpcBMa和pETDuet-cpcBs转入E.coli BL21（DE3）感受态细胞，在IPTG的诱导下表达，产生重组蛋白CpcB，Vo、Cpc BMa和CpcBSp。收集的细胞进行SDS-PAGE电泳检测，结果（图4）显示目的蛋白分子量为2.Oxl04左右，与预期基本相符。用亲和层析法提纯重组蛋白后，进一步进行SDS-PAGE电泳检测，结果（图4）显示蛋白质大小和预期的基本一致，目的条带清晰，没有杂带，纯度较高。

2.5 3种重组藻蓝蛋白的抗氧化性

测定不同质量浓度的重组蛋白CpcB No、CpcBMa和CpcBSp的抗氧化能力，包括对羟基自由基和DP-PH自由基的清除能力。结果（图5）表明，重组蛋白对羟基自由基的清除率依赖于所测重组蛋白的质量浓度，随着重组蛋白的质量浓度的增加而不断升高。质量浓度为50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml的CpcBSp对羟基自由基的清除能力分别为45%、71%、73%、79%和82%，不同质量浓度CpcBwa对羟基自由基的清除能力分别为51%、72%、76%、83%和89%，不同质量浓度CpcBNo对羟基自由基的清除能力分别为56%、76%、83%、88%和93%。在各种蛋白质质量浓度下，CpcBNo对羟基自由基的清除率均显著高于CpcBSp;在100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml的质量浓度下，CpcBSp和CpcBMa对羟基自由基的清除率无显著差异;在50μg/ml和250μg/ml的质量浓度下，CpcBMa对羟基自由基的清除能力显著高于CpcBsp。重组蛋白对羟基自由基的清除能力都高于对照甘露醇。

3 讨论

藻蓝蛋白具有抗氧化性，可以直接从蓝细菌中提取。由于分子克隆技术的运用和藻蓝蛋白生物合成机制的解析，藻蓝蛋白也能重组产生，且表现出更好的抗氧化效应。从大肠杆菌中提取蛋白质比从蓝藻中提取更为简单，故重组藻蓝蛋白引起广泛关注。藻蓝蛋白的抗氧化性不仅与色素有关，也有脱辅基蛋白的贡献。利用脱辅基蛋白的抗氧化能力可以避免复杂的色素蛋白合成过程，提高重组的稳定性和蛋白质产量。本研究中，我们在大肠杆菌中重组3种蓝细菌藻蓝蛋白β亚基的脱辅基蛋白并评估其抗氧化能力。结果表明，3种藻蓝蛋白对羟基自由基的清除效率均与质量浓度有關，当蛋白质质量浓度为100μ/ml时，CpcBNo、CpcBMa和CpcBsp对羟基自由基的清除率均已超过50%，分别为76%、72%和71%，三者较为接近，它们

重组蛋白对DPPH自由基的清除能力也随着重组蛋白浓度的升高而逐步提高（图5）。重组蛋白质量浓度为50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml时，CpcBSp对DPPH自由基的清除能力分别为3%、11%、20%、27%和43%，CpcBMa对DPPH自由基的清除能力分别为7%、14%、25%、37%和49%，CpcB No对DPPH自由基的清除能力分别为8%、15%、26%、40%和58%。在较高浓度（250μg/ml）时，CpcBNo明显比CpcBMa和CpcBSp具有更强的DPPH自由基清除能力，但是它们的清除能力都低于对照抗坏血酸。3种重组蛋白对羟基自由基的清除能力比对DPPH自由基的清除能力都要强。的蛋白质氨基酸序列有高达79%的同源性。Cherd-kiatikul等也报道钝顶螺旋藻CpcB的抗氧化性，样品质量浓度为100μg/ml时，对羟基自由基的清除率未超过50%。这种差异可能并不完全反映其抗氧化能力的差异，也有试验过程的原因，但对照甘露醇对羟基自由基清除率与先前的报道基本一致。3种重组蛋白中CpcBNa。的羟基自由基清除率最高。基于氨基酸序列的在线预测工具预测结果显不，CpcBNo的水溶性参数高于CpcBMa和CpcBSp，它们的水溶性参数分别为47%、35%和33%，这是造成它们抗氧化性差异的原因之一，但也有可能是其抗氧化活性位点并未完全处在保守性区域，其分布表现同质性。藻蓝蛋白对DPPH自由基的清除率比对羟基自由基的清除率要低得多。质量浓度达到100μg/ml时，CpcB No、Cpc BMa和CpcBsp对DPPH自由基的清除率均未超过15%，分别为15%、14%和11%。但对DPPH自由基清除能力仍表现为CpcBNo>CpcBMa> CpcBsp，其趋势与对羟基自由基清除能力一致。这也再次说明鱼腥藻CpcB具有较好的抗氧化潜力。

总之.3种重组蛋白具有显著的抗氧化潜力，可以开发为抗氧化试剂。不同蓝藻的重组藻蓝蛋白的抗氧化性较为接近，这归因于它们的氨基酸序列具有较高的同源性。重组藻蓝蛋白抗氧化性也存在一定差异，这表明通过选择不同蓝细菌藻蓝蛋白是提高重组藻蓝蛋白抗氧化能力的有效途径。藻蓝蛋白脱辅基蛋白的抗氧化机理还需更多的研究证实。研究不同藻种的藻蓝蛋白抗氧化能力及其差异是研究其抗氧化机制的重要途径。也可以通过蛋白质遗传改造的方式提高藻蓝蛋白的抗氧化活性，为藻蓝蛋白在食品加工和医疗上的广泛应用奠定基础。