瑶药冷骨风质量控制方法研究

陆峥琳 薛亚馨 黄瑞松 苏青

摘 要：瑶药冷骨风来源于睡莲科植物萍蓬草（Nuphar pumilum）的干燥根茎，为瑶族人习用药材，具有止咳补虚、除蒸止汗、祛瘀调经、止血的作用，目前历版《中国药典》和地方标准并未有收载其质量控制方法。该研究收集了10批冷骨风药材，采用生药鉴别方法对冷骨风药材性状进行显微鉴别，用TLC（薄层色谱）法对药材进行定性鉴别，用高效液相色谱法对没食子酸含量进行测定。结果表明：（1）色谱柱为Welch Ultimate XB-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.05%磷酸溶液（5∶95），流速为1.0 mL·min-1，检测波长为272 nm，柱温为室温。（2）建立了冷骨风药材性状、显微、TLC鉴别方法。（3）含量测定中没食子酸在0.072 1～0.360 5 μg范围时，进样量与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为103.66%，RSD为2.03%（n=6）。（4）10 批样品没食子酸含量为0.82%～1.23%，平均含量为0.94%。因此，建立的瑶药冷骨风质量控制方法具有较强的科学性，可用于冷骨风药材的质量控制。

关键词：瑶药，冷骨风，性状，显微鉴别，薄层色谱，含量测定

中图分类号：Q946.33

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2018）05-0552-08

Abstract：Yao medicine Lenggufeng is the dried rhizome of Nuphar pumilum，which was commonly used by Yao people. The herb medicine can be widely used for relieving cough，reinforcing deficiency，eliminating steam，hidroschesis，removing blood stasis，regulating menstruation and hemostasis. But the method for quality control of N. pumilum is not recorded in different versions of Chinese Pharmacopoeias or local quality standard of herbal medicine. Ten batches of herb medicine were collected in this study. The traits and microscopes of Nuphar pumilum were identified by crude drug identification method，the qualitative determination were performed by TLC，and the contents of gallic acid in these samples were determined by HPLC. The results were as follows：（1） The column was Welch Ultimate XB-C18 （4.6 mm × 250 mm，5 μm） with mobile phase of methanol-0.05% phosphoric acid（5∶95） at a flow rate of 1.0 mL·min-1，detection wavelength was 272 nm，column temperature was room temperature. （2） The identification method for the traits，microscopes and TLC were established. （3） The gallic acid showed a good linear relationship within the range of 0.072 1-0.360 5 μg ，whose average recovery （n=6） was 103.66%，with the RSD of 2.03%. （4） Gallic acid contents for the ten batches of samples were 0.82%-1.23%，and the average content was 0.94%. This established quality control method has strong scientificity and can be used for the quality control of N. pumilum.

Key words：Yao medicine， Nuphar pumilum，traits， microscopic identification， TLC，content detemination

冷骨風，瑶语“南迸崩”，俗称萍蓬草、水莲藕、鱼虱草等，为瑶族习用药材。广西瑶医在长期实践中逐渐形成了瑶族“老班药”，包括了瑶药的“九牛五虎七十二风”，冷骨风则为“七十二风”的“风药”之一（戴斌，2009）。经考证，本品为睡莲科植物萍蓬草（Nuphar pumilum）的干燥根茎。冷骨风原植物主要分布于黑龙江、吉林、河北、江苏、浙江、江西、福建、广东、广西等地（中国科学院中国植物志编辑员会，1979；全国中草药汇编编写组，1990；国家中医药管理局中华本草编委会，1999），广西主要分布于金秀、恭城、龙胜、全州、桂林、阳朔等地（覃海宁和刘演，2010； 黄瑞松，2015），生于湖沼或水塘中。瑶医认为，冷骨风性寒、味甘，属风药，具有止咳补虚，除蒸止汗，祛瘀调经，止血作用，临床用于尼椎改闷（肾虚腰痛），哈路（肺结核），悲寐掴（神经衰弱），辣给昧对（月经不调），泵卡西众（消化不良）及冲翠臧（外伤出血）等。

经查历版《中国药典》和地方药材标准，均未见收载有冷骨风的标准。该药材长期以来处于无标准控制的状态中，致使该药材质量无法控制，给临床用药安全有效及药材的开发利用带来了诸多问题。据文献（彭海鹏，1997）记载，同属植物日本萍蓬草的根状茎和果实含有没食子酸和生物碱等成分。前人的药理试验结果表明，没食子酸具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抑菌、心血管保护、降血糖、防治神经退行性疾病等活性（Inoue et al，2000；Ruohola et al，1995；钟振国等，2009；许维国等，2012）。为了制订冷骨风质量标准，本研究采集10批冷骨风药材样品，并对其药材性状、显微、TLC和以没食子酸为指标 （魏学军等，2015；付煜荣等，2006；于波涛等，2011）对含量测定等方法进行研究，建立瑶药冷骨风质量控制方法，为该药材质量标准制订提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

仪器：Agilent 1100 HPLC；岛津LC-20AT HPLC；宁波新芝SB3200DTS双频超声清洗仪；梅特勒XS205B电子分析天平（1/105）；热电EASYPURE Ⅱ超纯水器。试剂：没食子酸对照品为中国食品药品检定研究院提供；液相流动相甲醇为色谱纯（德国默克股份两合公司）；其余试剂为分析纯。材料：冷骨风药材共收集10批，各批次药材信息见表1。其中，1号药材同时采集了对号植物腊叶标本，见图1。广西中医药大学韦松基教授和广西食品药品检验所黄燮才主任技师对标本进行鉴定，确定其为睡莲科植物萍蓬草（Nuphar pumilum），本研究中将其作为对照药材。

1.2 药材真伪鉴别

1.2.1 性状鉴别 采用经验方法（眼看、手摸、鼻闻、口尝），对10批冷骨风药材的大小、质地、形状、性味进行观察，确定药材的性状。

1.2.2 显微鉴别 （1）横切面观察：取冷骨风的根茎，按石蜡切片法制作横切面片，进行横切面观察。（2）粉末观察：取干燥药材粉碎，过60目筛，将粉末放置载玻片上，滴加水合氯醛1～2滴透化，再滴加稀甘油1～2滴装片，或直接滴加稀甘油装片，观察，确定药材的显微特征。

1.2.3 TLC鉴别 （1）鉴别1：取本品粉末0.5 g，加50%甲醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇定容至1 mL，作为供试品溶液；取萍蓬草對照药材0.5 g，参照上述方法制成对照药材溶液；取没食子酸对照品，加甲醇制成浓度为1 mg·mL-1溶液，作为对照品溶液。在同一硅胶H薄层预制板上点样，供试品、对照药材和对照品溶液点样量为1～3 μL，展开剂为甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲酸（5∶4∶0.5∶0.5），显色为喷以1%铁氰化钾溶液-1%三氯化铁溶液（1∶1）混合溶液（临用配制），放置至斑点显示清晰。（2）鉴别2：取鉴别1项下制备的相应溶液作为供试品溶液和对照药材溶液。在同一硅胶G薄层预制板上点样，供试品和对照药材溶液点样量为3～5 μL，展开剂为正丁醇-冰醋酸-水（8∶1∶1），显色为喷以改良碘化铋钾试液，放置至斑点显示清晰。（3）耐用性实验：分别对不同品牌薄层预制板（青岛海洋化工厂分厂和烟台市化工研究所提供）、不同展开温度（8和26 ℃）、不同展开相对湿度（50%和88%）和不同点样方式（点状和条带状点样）进行考察。

1.3 药材没食子酸的含量测定

1.3.1 溶液制备 取没食子酸对照品适量，精密称定，加水制成30 μg·mL-1的水溶液，作为对照品溶液；取冷骨风样品粉末（过四号筛）0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10 mL 10%盐酸溶液，回流2 h，放冷，滤过，取滤液定容至置100 mL，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；取10%盐酸溶液作为阴性对照溶液。

1.3.2 测定条件 采用Welch Ultimate XB-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.05%磷酸溶液（5∶95）；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为272 nm；柱温为室温；理论板数按没食子酸峰计算应不低于2 000。

1.3.3 专属性考察 分别精密吸取上述1.3.1项的对照品、供试品和阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，照1.3.2项条件测定，记录色谱图。

1.3.4 线性关系考察 取没食子酸对照品适量，加水制成浓度为144.20 μg·mL-1的溶液，备用。分别精密吸取以上对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，各加10%盐酸定容至10 mL。各精密吸取上述不同浓度对照品溶液10 μL进样测定，以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积值为纵坐标，进行线性回归，计算回归方程及r值。

1.3.5 方法学考察 （1）精密度实验：取6号样品的同一供试品溶液，连续进样测定6次，以考察仪器的精密性。（2）重复性实验：取6号样品粉末，照1.3.1项方法平行制备6份供试品溶液，测定各自含量，以考察方法的重复性。（3）稳定性试验：取6号样品同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、24 h进样测定，以考察供试品溶液在24 h内的稳定性。（4）回收率实验：取没食子酸对照品，加10%盐酸制成浓度为 0.122 mg·mL-1的溶液，另取6号样品粉末6份，每份约0.1 g，分别精密称定，各精密加入上述对照品溶液10 mL，照1.3.1项方法制备供试品溶液，进样测定并计算加样回收率。

1.3.6 耐用性试验 （1）色谱柱的考察：采用同一台液相色谱仪，对Welch Ultimate XB-C18、依利特Hypersil ODS2-C18、菲罗门Gemini C18 三根色谱柱（规格均为4.6 mm × 250 mm，5 μm）进行考察，分别测定6号样品中没食子酸的含量。（2）色谱仪的考察：采用同一根色谱柱，分别对Agilent 1100、岛津LC-20AT两台色谱仪进行考察，分别测定6号样品中没食子酸的含量。

2 结果与分析

2.1 药材性状特征

冷骨风药材呈长条状类圆柱形或不规则形，直径2～5 cm。外表黄白色至棕黄色或棕黑色，具多数突起的根痕及叶痕。质轻脆，易折断。断面黄白色至淡棕色，密布圆孔，有筋脉点散在。气微香，味淡。结果如图2所示。

2.2 显微特征

2.2.1 横切面特征 表皮细胞1列，类方形。外皮层细胞排列紧密，壁稍有加厚。内侧薄壁细胞数个相连组成网状结构，形成大小不一的通气道，细胞内含淀粉粒。维管束外韧型， 散布在薄壁组织中。结果如图3所示。

2.2.2 粉末特征 灰白色至黄棕色。淀粉粒众多，脐点点状、一字型、人字形，直径8～55 μm，复粒淀粉由2～4单粒组成。导管主要为螺纹和梯纹导管，直径15～67 μm。表皮细胞黄色，类方形（图4）。

2.3 TLC鉴别结果

（1）鉴别1：在日光下，9批供试品色谱中均可检出对照药材和对照品色谱相对应的蓝色斑点，具有良好的重现性，结果如图5所示。（2）鉴别2：在日光下，9批供试品色谱中均可检出对照药材相对应的橙红色斑点，具有良好的重现性，结果如图6所示。（3）耐用性试验：在不同品牌薄层预制板、不同展开温度、不同展开相对湿度和不同点样方式的条件下，TLC鉴别方法均具有良好耐用性。

2.4 含量测定方法考察及样品测定结果

2.4.1 专属性考察结果 供试品溶液色谱图与没食子酸对照品溶液色谱图在相同保留时间具有吸收峰，阴性对照液在相同时间无吸收峰，说明本方法无阴性干扰。结果如图7所示。

2.4.2 线性关系测定结果 没食子酸对照品进样量在0.072 1～0.360 5 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为Y=5 502.9X-127.1，r=0.999 6。

2.4.3 方法学考察结果 连续6次测定的没食子酸峰面积的平均值为1 098，RSD=0.36%，表明该仪器的精密度良好；平行测定6份样品的没食子酸含量的平均值为1.24%，RSD=1.39%，表明该方法的重复性良好；稳定性试验测得没食子酸含量的平均值为1.22%，RSD=1.55%，表明供试品溶液在24 h内稳定；没食子酸含量的平均回收率为103.66%（n=6），RSD=2.03%，表明该方法准确度良好。具体结果如表2所示。

2.4.4 耐用性試验结果 三根色谱柱测得没食子酸含量平均值为1.24%，RSD=1.00%，表明本研究建立的测定方法对所测的不同品牌色谱柱有一定的耐用性；两台色谱仪测得没食子酸含量平均值为1.25%，RSD=2.51%，表明本研究建立的测定方法对所用不同品牌色谱仪具有一定的耐用性。

2.4.5 10批样品含量测定结果 10批样品以药材干燥品计算，没食子酸含量为0.82%（8号）～1.23%（6号），平均值为0.94%。考虑到实际中药材来源差异情况的因素，故拟定本品按干燥品计算，没食子酸含量不得少于0.50%（表3）。

3 讨论

民族药的标准化是民族药发展的技术关键。过去，由于历史的原因，民族药的发展较缓慢，许多基础研究一直滞后，特别是在民族药质量标准方面，许多民族药材一直处于无标准控制状态中，严重影响了临床用药和生产的安全有效和民族药资源的开发利用。因此，开展民族药标准化研究，对于规范民族药的生产、流通、临床用药具有重要意义，也为科研和检验提供了法定技术依据。

药材的真伪鉴别目前仍然以药材性状、显微和TLC鉴别方法为主。过去，人们对冷骨风药材的生药学研究甚少，对其鉴别多以经验的性状鉴别为依据。该文通过试验，建立的性状、显微和TLC鉴别方法具有较强的专属性，可从不同方面为冷骨风药材的真伪鉴别提供技术依据。

在药材质量标准中，含量测定项的控制具有重要意义，是评价药材质量优劣的重要指标。经查阅文献，冷骨风的化学成分方面的报道甚少，未见有冷骨风含量测定方法的报道。为了准确评价该药材的质量优劣，该文采用HPLC法建立了冷骨风药材没食子酸含量测定方法。经方法学考察，表明本方法专属性强，无阴性干扰，精密度和准确度均较高，具有良好的重复性和重现性，样品预测成分的回收率达到103.66%，说明该文建立的含量测定方法是可行的，可用于瑶药冷骨风的质量控制和质量评价。

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