毛咀地星的抗氧化、抗菌和抗肿瘤活性和化学成分研究

刘坤　刘名飞　王俊丽　于子箫

摘要： 毛咀地星是一种药用蘑菇，为了进一步开发利用毛咀地星，该研究探讨了毛咀地星乙醇提取物的抗氧化、抗菌和抗肿瘤活性，并采用硅胶柱色谱、制备薄层色谱和重结晶等方法，对毛咀地星乙醇提取物进行分离纯化，研究了其化学成分。结果表明：毛咀地星乙醇提取物多酚含量为10.53 μg·mg-1，DPPH和·OH自由基清除能力的IC50值分别为91.35和148.76 μg·mL-1；乙醇提取物对金黄葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽抱杆菌均无抑制作用；乙醇提取物在浓度为1 mg·mL-1时，对燕麦镰刀菌的抑制率为36.11%；乙醇提取物在浓度为200 μg·mL-1时，对BG-803、NCI-H502和MDA-MB-231肿瘤细胞的抑制率分别为18.87%、17.71%和41.23%。并从乙醇提取物中分离纯化到6个化合物，根据理化性质和波谱数据分析，化合物结构分别鉴定为5α，8α-过氧化麦角甾-6，9（11），22-三烯-3β-醇（1）、5α，8α-过氧化麦角甾-6，22-二烯-3β-醇（2）、D-阿拉伯糖醇（3）、L-谷氨酸（4）、麦芽糖（5）和蔗糖（6），以上化合物均为首次从该菌中分离得到。

关键词： 毛咀地星， 抗氧化活性， 抗菌活性， 抗肿瘤活性， 化学成分

中图分类号： Q946， R284文献标识码： A文章编号： 1000-3142（2018）07-0953-07

Abstract： Geastrum fimbriatum is a kind of medicinal mushroom with hemostasis， clearing lung and alexipharmic functions. For the further study on the development and utilization of G. fimbriatum， the antioxidant， antibacterial and anticancer activities and the chemical constituents of the ethanol extract （EE） from G. fimbriatum were evaluated. The present study exhibited that the total phenolic content of EE was 10.53 μg·mg-1 EE DPPH and ·OH radical-scavenging activities with IC50 values of 91.35 and 148.76 μg·mL-1， respectively. EE showed no antibacterial activity on Staphylococcus aureus， Escherichia coli and Bacillus subtilis. Meanwhile， EE displayed antifungal activity on Fusarium avenaceum with inhibition ratio of 36.11% at the concentration of 1 mg·mL-1. EE displayed anticancer activities against tumor cells BG-803， NCI-H502 and MDA-MB-231 with the inhibition ratio of 18.87%， 17.71% and 41.23% respectively at the concentration of 200 μg·mL-1 （MTT assay）. Six compounds were isolated from EE by the methods of column chromatography， thin layer chromatography， recrystallization and so on. The structures were elucidated by the analysis of spectral data and physical-chemical properties and identified as 5α， 8α-epidioxyergosta-6， 9（11）， 22-triene-3β-ol （1）， 5α， 8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3β-ol （2）， D-allitol （3） ， L-glutamic acid （4）， maltose （5）， saccharose （6）. All the six compounds were isolated from G. fimbriatum for the first time.

Key words： Geastrum fimbriatum， antioxidant activity， antibacterial activity， antitumor activity， chemical constituents

毛咀地星（Geastrum fimbriatum）是一種药用蘑菇，为地星科地星属的一种，子实体较小，夏末秋初生于林中腐枝落叶层地上，在西藏、云南、河北、青海、河南、湖南、黑龙江等地都有分布。孢子粉有止血、消炎和解毒的作用（袁明生，2013）。目前地星属的研究主要集中在资源调查和分类学上，Kirk et al（2008）记载全世界有50多个种，韩冰雪和图力古尔（2016）记载目前中国有地星16种和1变种，其中3个中国地星属新种和新记录种。地星属已有菌种被报道具有抗氧化、抗菌和细胞毒性，如Guerra Dore et al（2007）报道袋形地星（Geastrum saccatun）含有丰富的β葡聚糖，有消炎、抗氧化和细胞毒活性；Kim et al（2012）报道葫芦地星（G. lageniforme）甲醇提取物有抗氧化活性；Chittaragi et al（2013）报道尖顶地星（G. triplex）的石油醚、氯仿和甲醇提取物有抗菌活性。但目前尚未见有毛咀地星生物活性和化学成分分析的研究报道。笔者首次对毛咀地星子实体的乙醇提取物进行抗氧化、抗菌和抗肿瘤活性研究，从乙醇浸提物中分离到6个化合物，均为首次从该菌中分离得到，为毛咀地星的开发利用提供了科学依据。

1材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

材料：毛咀地星（Geastrum fimbriatum）采自内蒙古克什克腾旗，经河北经贸大学张香美教授鉴定，标本放在中央民族大学生命科学与环境学院。金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis）购自中国科学院微生物菌种保藏管理中心；禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、白斑小尾孢（Cercosporella albo-maculans）和燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）由沈阳农业大学提供；NCI-H502（人肺鳞状上皮细胞癌）、BG-803（人胃癌细胞）和MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）由中国医学科学院基础所细胞中心提供。

仪器：Bruker DRX 500超导核磁共振波谱仪；Agilent 6890N-5975N质谱仪；Thermo Lab systems全自动酶标仪；VERTEX 70傅立叶红外光谱仪；Olympus CH普通倒置显微镜。试剂：DPPH 为美国Sigma公司生产；抗坏血酸标准对照品为广东汕头西陇化工厂生产；其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 提取与分离

毛咀地星子实体（干重1.5 kg），用95%乙醇浸提4次，每次7 d，合并减压蒸干得100 g粗体物，留取10 g粗提物做活性。以石油醚∶丙酮（10∶1、8∶1、5∶1、3∶1、2∶1、0∶1）为洗脱剂进行梯度洗脱，经薄层层析检测，合并相同部分，得6个组分（Fr.A-Fr.F）。Fr.C组分经硅胶柱层析进行分离，以石油醚∶乙酸乙酯（1∶1）为洗脱剂进行洗脱，得2个亚组分（Fr.C1和Fr.C2）。Fr.C1亚组分经Sephadex LH-20色谱柱层析，再经TLC制备色谱（GF254，石油醚∶乙酸乙酯=2∶1，展1次），得化合物1（4.4 mg）。Fr.C2亚组分经重结晶得化合物2（5.7 mg）。Fr.E组分经硅胶柱层析进行分离，以石油醚∶丙酮（2∶1）为洗脱剂进行洗脱，得2个亚组分（Fr.E1和Fr.E2）。Fr.E1组分经Sephadex LH-20色谱柱层析，得化合物3（3.1 mg）。Fr.E2组分经Sephadex LH-20色谱柱层析，硅胶柱层析进行分离，以氯仿∶丙酮（1∶1）为洗脱剂进行洗脱，得化合物4（2.2 mg）。Fr.F組分经硅胶柱层析进行分离，以石油醚∶丙酮（1∶1）为洗脱剂进行洗脱，重结晶得化合物5（4.1 mg）和6（4.7 mg）。

1.3 乙醇提取物体抗氧化活性分析

1.3.1 总酚含量测定参照Liu et al（2013）的方法，根据标准品没食子酸标准曲线确定的方程计算酚含量， 线性范围为2～14 μg·mL-1。方程为Y=0.006 2X + 0.064 7， R2=0.999 3。

1.3.2 DPPH自由基清除实验参照何月秋等（2017）的方法，并稍作改动。配制不同浓度的样品，分别取100 μL样品和100 μL 60 μmol·L-1的DPPH乙醇（95%）溶液混合，放入酶标仪中震动摇匀，暗反应30 min。517 nm 下测量吸光度（A）。对照组和处理组都重复3次。

DPPH自由基清除率=（A对照-A样品）/A对照×100%（1）

式中，A对照为对照的吸光值，A样品为加样品反应液的吸光度值。抗坏血酸作为阳性对照。

1.3.3 羟自由基清除实验参照Grymonpré et al（2001）的方法，并稍作改动。200 μL反应体系中含有各种不同浓度的待测化合物100 μL，FeSO4·7H2O（9 mmol·L-1）20 μL，H2O2（8.8 mmol·L-1）20 μL，水杨酸-乙醇溶液（9 mmol·L-1）20 μL，在 37 ℃的恒温水中反应 30 min 后，用酶标仪在510 nm下测量吸光度（A）。羟自由基清除率同公式（1），抗坏血酸作为阳性对照。

1.4 乙醇提取物体抗菌活性分析

1.4.1 抗细菌试验抑菌圈采用打孔法进行测定（赵能等，2017）。将活化的供试菌调至浓度为1 × 106～1 × 107 CFU·mL-1的菌悬液。取0.1 mL菌悬液加到平板培养基表面，涂布均匀。用直径为0.6 cm打孔器在涂布均匀的平板上打孔。每孔加入50 μL（100 mg·mL-1）样品，37 ℃倒置培养24 h，观察抑菌圈，每样品3个平行板。5 mg·mL-1青霉素钠溶液为革兰氏阳性菌的对照品，10 mg·mL-1青霉素钠溶液为革兰阴性菌的对照品。

1.4.2 抗真菌试验待测样品对真菌的抑制作用采用侯颖等（2014）的菌丝生长速率法。空白对照（甲醇）、阳性对照（克霉唑，浓度为0.10 mg·mL-1）、加药处理（乙醇提取物，浓度为1 mg·mL-1），每个处理设3个重复。

相对抑制率 = （加药处理菌落平均直径-菌饼直径）/（空白对照菌落平均直径-菌饼直径）

1.5 乙醇提取物体抗肿瘤活性分析

参照汪婷等（2017）的方法（MTT法），研究乙醇提取物体对肿瘤细胞BG-803、NCI-H502和MDA-MB-231增殖的抑制活性。将计数后肿瘤细胞悬液先用培养基稀释至1 × 105个·mL-1，再加至96空板，每孔100 mL，放于培养箱培养12 h。将不同浓度的样品加入各个孔中，培养48 h；吸出各孔培养基，每孔先加入100 μL无菌PBS，再加入20 μL MTT（过程避光），培养4 h；吸出上清，各孔加入100 μL DMSO，摇10 min至各孔中澄清，检测570 nm的OD吸光值。阳性药物为紫杉醇。所有试剂均用0.2 μm无菌滤器除菌以保证整个实验过程严格无菌。

2结果与分析

2.1 化合物结构鉴定

化合物1白色不定型粉末（甲醇），mp 165～167 ℃。EI-MS：m/z= 426.3。1H NMR（500 MHz，CDCl3，δ，ppm，J/Hz）：0.75（3H，s，H-18），0.84（3H，d，J=7.0，H-26），0.84（3H，d，J=7.0，H-27），0.93 d（3H，d，J=7.0，H-28），1.00（3H，d，J=6.5，H-21），1.10（3H，s，H-19），3.96（1H，m，H-3），5.16（1H，dd，J=15.3，7.5，H-23），5.24（1H，dd，J=15.3，7.5，H-22），5.45（1H，dd，J=4.4，H-11），6.26（1H，d，J=8.5，H-6），6.52（1H，d，J=8.5，H-7）；13C NMR（125 MHZ，CDCl3，δ，ppm）：32.4（C-1），30.9（C-2），65.9（C-3），35.9（C-4），82.6（C-5），135.5（C-6），130.4（C-7），78.2（C-8），142.5（C-9），37.8（C-10），119.6（C-11），41.0（C-12），43.5（C-13）， 48.0（C-13）， 20.8（C-15）， 28.5（C-16），55.7（C-17），12.7（C-18），25.4（C-19），39.7（C-20），20.5（C-21），135.0（C-22），132.3（C-23），42.6（C-24），32.9（C-25），19.5（C-26），19.8（C-27），17.4（C-28）。数据与Kobor et al （2006）的一致，故鉴定为5α，8α-过氧化麦角甾-6，9（11），22-三烯-3β醇。

化合物2白色晶体（甲醇），mp 182～183 ℃。EI-MS： [M]+ m/z= 428.3。1H NMR（500 MHz，CDCl3，δ，ppm，J/Hz）：0.82（3H，S，H-18），0.83（3H，d，J=7.0，H-26），0.83（3H，d，J=7.0，H-27），0.89（3H，S，H-19），0.91（3H，d，J=7.0，H-28），1.00（3H，d，J=6.5，H-21），3.97（1H，m，H-3），5.14（1H，dd，J=15.3，7.5，H-23），5.21（1H，dd，J=15.3，7.5，H-22），6.23（1H，d，J=8.5，H-6），6.49（1H，d，J=8.5，H-7）；13C NMR（125 MHZ，CDCl3，δ，ppm）：34.6（C-1），30.3（C-2），74.02（C-3），36.7（C-4），82.1（C-5），135.4（C-6），130.5（C-7），79.3（C-8），51.0（C-9），36.7（C-10），20.6（C-11），39.2（C-12），44.4（C-13），51.5（C-13），23.2（C-15），28.5（C-16），56.0（C-17），12.7（C-18），18.0（C-19），39.5（C-20），20.7（C-21），135.1（C-22），132.2（C-23，42.6（C-24），32.9（C-25），19.5（C-26），19.8（C-27），17.4（C-28）。数据与甘秀海等（2013）的一致，故鉴定为5α，8α-过氧化麦角甾-6，22-二烯-3β醇。

化合物3无色棱状晶体（甲醇），mp 106 ℃。1H NMR（500 MHz，DMSO，δ，ppm，J/Hz）：3.54（1H，dd，J=11.8，2.3，1-Hax），3.53（1H，dd，J=11.9，6.8，1-Heq），3.69（1H，ddd，J=11.9，5.6，2.4，H- 2），3.79（1H，dd，J=12.0，5.6，H-3），3.65（1H，ddd，J=8.5，6.0，2.6，H- 4），3.45（1H，dd，J=11.5，5.68，5-Hax），3.43（1H，dd，J=11.5，8.4，5-Heq）；13C NMR（125 MHz，DMSO，δ，ppm）：63.3（C-1），70.6（C-2），70.8（C-3），71.3（C-4），63.3（C-5）。数据与李元伟（2016）的一致，故鉴定为D-阿拉伯糖醇。

化合物4白色无定型粉末（甲醇），mp 169～172 ℃。EI-MS：M+ m/z= 147.1。1H NMR（500 MHz，DMSO，δ，ppm，J/Hz）：4.68（1H，ddd，J=15.5，5.6，5.5，H-2），2.63（1H，dd，J=15.5，5.6，H-3a），2.55（1H，dd，J=15.5，5.6，H-3b），3.08（2H，t，J=15.5，6.2，H-4），7.71（2H，d，J=5.5，NH2）；13C NMR（125 MHz，DMSO，δ，ppm）：175.8（C-1），56.4（C-2），26.7（C-3），30.8（C-4），173.8（C-5）。数据与肖皖（2011）的一致，故鑒定为L-谷氨酸。

化合物5无色方晶（甲醇），mp 102～103 ℃。1H NMR（500 MHz，DMSO，δ，ppm，J/Hz）：5.02（1H，d，J=1.6，H-1），4.71（1H，d，J=3.6，H-1′）；13C NMR（125 MHz， DMSO，δ，ppm）：93.7（C-1），71.2（C-2），73.5（C-3），74.7（C-4），74.7（C-5），61.2（C-6），99.8（C-1′），72.7（d，C-2′），72.6（d，C-3′），69.7（C-4′），70.7（C-5′），60.2（C-6′）。数据与参考文献（黄悦，2002；李小第等，2015）的一致，固鉴定为麦芽糖。

化合物6无色方晶（甲醇），mp 185～186 ℃。1H NMR（500 MHz，D2O，δ，ppm，J/Hz）：4.45（1H，d，J=5.4，H-1），4.61（1H，s，H-6），4.72（1H，d，J=3.6，H-1′）；13C NMR（125 MHz，D2O，δ，ppm）：62.3（C-1），102.9（C-2），81.7（C-3），77.3（C-4），74.3（C-5），62.2（C-6），91.9（C-l′），71.9（C-2′），72.5（C-3′），69.4（C-4′），74.4（C-5′），70.1（C-6′）。数据与张文静等（2016）的一致，故鉴定为蔗糖。

2.2 乙醇提取物活性研究

2.2.1 抗氧化活性毛咀地星乙醇提取物的多酚含量为（10.53 ± 0.53）μg·mg-1，DPPH和·OH自由基清除活性呈浓度正相关关系（图 2）。当浓度为200 μg·mL-1时DPPH和·OH自由基清除率分别为（65.27 ± 0.71）%和（49.34 ± 0.44）%。IC50是清除率为50%时对应的样品浓度，值越大，表明清除活性越弱，反之，越强。毛咀地星乙醇提取物DPPH和·OH自由基清除能力的IC50分别为（91.35 ± 1.93）和（148.76 ± 1.60）μg·mL-1与抗坏血酸的IC50[（5.00 ± 0.31）和（20.55 ± 0.25）μg·mL-1]差异显著（P<0.05）。表明毛咀地星乙醇提取物有一定的DPPH和·OH自由基清除活性但低于抗坏血酸。目前已有同属菌的抗氧化研究报道，Guerra Dore et al（2007）指出袋形地星多糖提取物在200 μg·mL-1时， ·OH自由基清除率为（64.0±2.92）%，高于毛咀地星乙醇提取物。

2.2.2 抗菌活性毛咀地星乙醇提取物对三种病原图 2毛咀地星乙醇提取物的DPPH （A）和·OH （B）自由基清除作用细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）均没有表现出抑制作用，无抑菌圈出现。Chittaragi et al（2013）报道了同属尖顶地星甲醇提取物的抑菌活性，其抑菌活性与毛咀地星乙醇提取物表现出一致性，浓度为25%、50%和100%的尖顶地星甲醇提取物对大肠杆菌均无抑制活性，12.5%的尖顶地星甲醇提取物对金黄色葡萄球菌也无抑制活性。表1显示，毛咀地星乙醇提取物对禾谷镰刀菌和白斑小尾孢的抑制作用较小，差异不显著（P > 0.05），浓度为1 mg·mL-1时，抑制率分别为（19.10 ± 0.19）%和（20.24 ± 1.12）%。对燕麦镰刀菌的抑制率相对较高，1 mg·mL-1时为（36.11 ± 1.6）%，但低于阳性对照克霉唑（69.55 ± 2.46）%，且差异显著（P < 0.05）。

2.2.3 抗肿瘤活性毛咀地星乙醇提取物对BG-803（人胃癌细胞）、NCI-H502（人肺鳞状上皮细胞癌）和MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）都有较低的抑制作用，且呈浓度正相关关系（图 3）。在浓度为200 μg·mL-1时对BG-803、NCI-H502和MDA-MB-231细胞的抑制率分别为（18.87±0.62）%、（17.71±0.84）%和（41.23±0.39）%，都低于紫杉醇（98.32±1.4）%、（92.67±1.53）%和（98.11±1.85）%，且差异显著（P < 0.05）。其中毛咀地星乙醇提取物对MDA-MB-231的抑制性最强但低于紫杉醇。目前还未见到关于毛咀地星抗肿瘤活性研究的其它报道，但Guerra Dore et al（2007）指出袋形地星多糖提取物在0.5～1.5 mg·mL-1时，可抑制PMBC（外周血单核细胞）的存活，这也说明地星属的菌具有一定细胞毒活性，但活性不高。

3讨论与结论

由于地星属蘑菇种类相对较少，大量采集相对困难，目前地星属蘑菇的研究主要集中在资源调查和分类学上，关于此属的生物活性研究仅见几篇报道。本研究从毛咀地星中首次分离到6个化合物，包括2个甾体、1个氨基酸、1个糖醇、2个糖。其中5α，8α-过氧化麦角甾-6，22-二烯-3β-醇有抗氧化活性和抗肿瘤活性（刘坤等， 2013， 2014），说明毛咀地星的抗氧化和抗肿瘤活性与这种甾体可能有一定的相关性。毛咀地星乙醇提取物DPPH和·OH自由基清除能力的IC50分别为（270.43 ± 4.52）和（340.95 ± 2.83） μg·mL-1，在200 μg·mL-1時，毛咀地星乙醇提取物·OH自由基清除率为（49.34 ± 0.44）%，低于袋形地星多糖提取物的·OH自由基清除率（64.0±2.92）%（Guerra Dore et al，2007），说明地星菌多糖提取物的抗氧化活性可能要好于乙醇提取物，也可能是袋形地星的抗氧化活性好于毛咀地星，这有待进一步考证。毛咀地星乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌无抑制作用，与Chittaragi et al（2013）的结论基本一致，说明地星属的蘑菇可能对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制活性较差。毛咀地星乙醇提取物在浓度为1 mg·mL-1时，对燕麦镰刀菌的抑制率为（36.11 ± 1.6）%；在浓度为200 μg·mL-1时对MDA-MB-231细胞的抑制率为（41.23 ± 0.39）%，因此有待于进一步研究，纯化出活性更高的组分，用于抑制燕麦镰刀菌和MDA-MB-231细胞的生长。以上研究可为毛咀地星进一步的开发利用提供参考。

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