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辣蓼提取物对大鼠急性胃黏膜损伤的保护作用研究

2018-09-10任守忠苏文琴朱宏锐王宁牛海艳赵雅媚马志健

中国药房 2018年7期
关键词:超氧化物歧化酶

任守忠 苏文琴 朱宏锐 王宁 牛海艳 赵雅媚 马志健

中图分类号 R285;R961 文献标志码 A 文章编号 1001-0408(2018)07-0955-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.22

摘 要 目的:研究辣蓼提取物对大鼠急性胃黏膜损伤(AGML)的保护作用。方法:将48只大鼠随机分为正常组(生理盐水)、模型组(生理盐水)、阳性组(盐酸雷尼替丁,0.05 g/kg)和辣蓼提取物低、中、高剂量组(以生药量计分别为2.7、8.1、24.3 g/kg),连续灌胃给药7 d,每天1次。末次给药1 h后,除正常组外,其余各组大鼠均灌胃无水乙醇复制AGML模型。造模1.5 h后,计算各组大鼠胃黏膜损伤指数,观察大鼠胃组织病理学变化,采用酶联免疫吸附法测定大鼠胃组织中核因子E2相关因子2(Nrf2)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果:与正常组比较,模型组大鼠胃黏膜损伤明显,黏膜下层毛细血管破裂出血,胃黏膜损伤指数显著升高(P<0.01);胃组织中 Nrf2含量和SOD 活性显著降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,各给药组大鼠胃黏膜的损伤均不同程度减轻;阳性组和辣蓼提取物中、高剂量组大鼠胃黏膜损伤指数显著降低(P<0.05),胃组织中Nrf2含量和SOD 活性显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论:辣蓼提取物对无水乙醇致大鼠AGML具有较好的保护作用,其机制可能与提高胃黏膜组织中Nrf2含量和增强SOD 活性有关。

关键词 辣蓼提取物;急性胃黏膜损伤;核因子E2相关因子2;超氧化物歧化酶;大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE: To study the protective effects of Polygonum hydropiper extract on acute gastric mucosal lesion (AGML) in rats. METHODS: 48 rats were randomly divided into normal group (normal saline), model group (normal saline), positive group (ranitidine hydrochloride, 0.05 g/kg), P. hydropiper extract low-dose, medium-dose and high-dose groups (2.7, 8.1, 24.3 g/kg by crude drug), i.g. for consecutive 7 d, once a day. Except for normal group, other groups were given absolute ethyl alcohol to induce AGMI model after 1 h of last administration. 1.5 h after modeling, gastric mucosal lesion index of rats was calculated; the pathological changes of gastric tissue in rats were observed; nuclear factor E2 related factor 2 (Nrf2) content and SOD activity in gastric tissue of rats were determined by ELISA. RESULTS: Compared with normal group, the gastric mucosa of model group was damaged obviously, there was blood capillary rupture in submucosa, gastric mucosal lesion index was increased significantly(P<0.01); Nrf2 content and SOD activity were significantly decreased in gastric tissue of rats (P<0.05 or P<0.01). Compared with model group, gastric mucosal lesion of rats was relieved to different extent; in positive group, P. hydropiper extract medium-dose and high-dose groups, gastric mucosal lesion index was decreased significantly (P<0.05), and Nrf2 content and SOD activity were increased significantly(P<0.05 or P<0.01). CONCLUSIONS: P. hydropiper extract has good protective effect on absolute ethyl alcohol-induce AGMI, the mechanism of which may be associated with raising Nrf2 content and enhancing SOD activity in gastric mucosal tissue.

KEYWORDS Polygonum hydropiper extract; Acute gastric mucosal lesion; Nuclear factor E2 related factor 2; SOD; Rats

辣蓼為蓼科(Polygonaceae)蓼属植物辣蓼(Polygonum hydropiper Linn.)的干燥全草,也称水蓼、蓼芽菜、柳蓼,其味辛、酸,性温,具有祛风利湿、解毒消肿、散瘀止痛、杀虫止痒等功效,主治风湿性关节痛、疥癣、胃肠炎、功能性子宫出血、痢疾、腹泻、脚气和跌打肿痛等[1],其主要含黄酮和倍半萜和酚酸类成分。药理研究表明,辣蓼具有广谱的抗菌以及抗炎、抗氧化、抗腹泻等作用[2-3],在临床上用于治疗急、慢性胃肠炎,具有良好疗效。研究表明[4-5],在急性胃黏膜损伤(AGML)的发生发展过程中氧自由基参与并发挥了重要作用,过量自由基会引起脂质过氧化及共价键结合,从而造成胃黏膜损伤。超氧化物歧化酶(SOD)能清除自由基,减轻过量自由基引起的损伤。核因子E2相关因子2(Nrf2)是调节体内氧化应激状态的关键性因子,其通过激活机体内源性抗氧化应激通路,保护胃黏膜免受氧化应激损害[6]。故本研究旨在观察辣蓼提取物对大鼠AGML的改善作用,并通过考察胃组织中Nrf2含量和SOD活性对其可能的作用机制进行探讨,为防治胃肠疾病中药的研发奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

TP-1200C电子天平(湘仪天平仪器设备有限公司);TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂);DZF- 6020真空干燥箱(上海申贤恒温设备厂);T25电动匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司);MK3酶标仪[赛默飞世尔(上海)仪器有限公司)];BH-2光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 药品与试剂

盐酸雷尼替丁胶囊(石家庄四药有限公司,批号:LN140967,规格:0.15 g/粒);SOD、Nrf2试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20160428、20160503);甲醇(广东光华科技股份有限公司,批号:20140919,分析纯);无水乙醇(西陇化工股份有限公司,批号:15070702,纯度:99.5%)。

1.3 药材

辣蓼于2016年5月采自海南省,经海南医学院药学院曾念开老师鉴定为蓼科蓼属草本植物辣蓼(Polygonum hydropiper Linn.)的干燥全草。

1.4 动物

SD大鼠48只,清洁级, ♀♂各半,体质量(180±20) g,购自长沙市天勤生物技术有限公司[动物生产许可证号:SCXK(湘)2014-0011]。购入后将大鼠饲养于室溫为25~27 ℃的动物房中,饲养期间自由进食饮水,适应性饲养3 d后用于实验。

2 方法

2.1 辣蓼提取物的制备

取辣蓼药材1 kg,粉碎成粗粉,加10倍量水浸泡2 h,然后加热煮沸2 h,滤过,收集滤液;滤渣加8倍量水加热煮沸1.5 h,滤过,收集滤液;滤渣继续加6倍量水加热煮沸1 h,滤过。合并3次滤液,浓缩,即为辣蓼水提液。取一定量辣蓼水提液上AB-8大孔吸附树脂,先用蒸馏水洗脱,然后用70%乙醇洗脱,收集70%乙醇洗脱液,即得。

2.2 分组与给药

将48只大鼠按体质量随机分为6组,分别为正常组、模型组、阳性组和辣蓼提取物低、中、高剂量组,每组8只。正常组和模型组大鼠灌胃生理盐水,阳性组大鼠灌胃盐酸雷尼替丁水溶液0.05 g/kg(根据成人临床用量按照换算系数法换算而得),辣蓼提取物低、中、高剂量组大鼠分别灌胃辣蓼提取物(以生药量计分别为2.7、8.1、24.3 g/kg,其中低剂量为成人临床用量按照换算系数法换算而得,各组大鼠均每天给药1次,连续给药7 d。

2.3 AGML模型的制备

末次给药前,各组大鼠均禁食不禁水24 h。末次给药后1 h,除正常组以外,其余各组大鼠均灌胃无水乙醇(1.5 mL/只)诱导AGML[7]。

2.4 胃黏膜膜损伤指数的测定

造模1.5 h后,脱颈处死大鼠,打开腹腔,取出全胃,沿着胃大弯剪开,用生理盐水冲洗胃内容物,吸水纸吸干,将胃平铺于试纸上,置于10倍放大镜下肉眼观察,用游标卡尺测量胃黏膜损伤长度和宽度,分级计分[8]:斑点糜烂≤1 mm,计1分;1 mm<损伤长度≤2 mm,计2分;2 mm<损伤长度≤3 mm,计3分;3 mm<损伤长度≤4 mm,计4分;损伤长度>4 mm,分段计分;宽度≥2 mm则计分加倍。累计得分即为胃黏膜损伤指数。

2.5 胃组织病理形态学的观察

将胃组织置于4%中性福尔马林中固定,石蜡包埋,4 μm切片,苏木精-伊红(HE)染色,光学显微镜下观察大鼠胃组织病理形态学变化。

2.6 胃组织中Nrf2含量和SOD活性的测定

取胃组织用滤纸拭干,称质量,剪碎,放入5 mL离心管中,取9倍量冰生理盐水于离心管中,用组织匀浆机充分研磨制成10%组织匀浆,然后以5 000×g离心10 min,取上清,备用。采用酶联免疫吸附法检测胃组织中Nrf2含量和SOD活性,具体操作按照相应试剂盒说明书进行。

2.7 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行分析。数据以x±s表示,组间比较采用单因素方差分析和t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 胃黏膜损伤指数测定结果

与正常组比较,模型组大鼠胃黏膜损伤严重,胃黏膜损伤指数明显升高(P<0.01),提示AGML大鼠模型制备成功。与模型组比较,阳性组和辣蓼提取物中、高剂量组大鼠胃黏膜损伤减轻,胃黏膜损伤指数明显降低(P<0.05),结果见表1。

3.2 胃组织病理学观察结果

正常组大鼠胃黏膜层光滑完整、结构层次清晰,黏膜下层及肌层完好。模型组大鼠黏膜破损、不完整,部分腺体被破坏;黏膜下层内毛细血管破裂出血及渗出。辣蓼提取物低剂量组大鼠黏膜表层不完整,部分脱落。阳性组和辣蓼提取物中、高剂量组大鼠黏膜层完整,腺体细胞排列比较整齐;黏膜下层及浆膜层基本完整,各组大鼠胃组织病理学观察结果见图1。

3.3 胃组织中Nrf2含量和SOD活性测定结果

与正常组比较,模型组大鼠胃组织中Nrf2含量和SOD 活性均显著降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,辣蓼提取物中、高剂量组大鼠胃组织中Nrf2含量明显升高(P<0.05或P<0.01),阳性组和辣蓼提取物中、高剂量组大鼠胃组织中SOD活性均明显升高(P<0.05或P<0.01),其中以辣蓼提取物高剂量组升高最为显著,结果见表2。

4 讨论

引起胃黏膜损伤的因素众多,主要原因是由于胃黏膜防御因子和损伤因子的平衡消失[9-11]。乙醇是引发胃黏膜损伤的重要攻击因子之一,进入人体后的乙醇大约有20%以上的乙醇在胃部吸收,其能直接损伤胃黏膜和破坏胃黏膜屏障而导致胃黏膜损伤[12]。本研究采用无水乙醇诱导大鼠AGML,研究辣蓼提取物对AGML的防治作用。病理结果显示,模型组大鼠黏膜损伤明显,部分腺体被破坏;黏膜下层内毛细血管破裂出血及渗出。辣蓼提取物中、高剂量组大鼠胃黏膜层基本完整,腺体细胞排列比较整齐,黏膜下层及浆膜层较完好,且胃黏膜损伤指数显著降低,而辣蓼提取物低剂量组大鼠胃黏膜破坏仍明显,部分黏膜腺脱落,这说明中、高剂量辣蓼提取物能明显减轻无水乙醇所致大鼠胃黏膜损伤。

SOD是机体内一种重要的内源性氧自由基清除剂,能有效地清除氧自由基,抑制胃黏膜中的脂质过氧化反应,并能稳定细胞膜,起到保护胃黏膜的作用[13],故机体内环境中SOD活性的高低可间接性地反映机体清除自由基的能力。由表2结果可知,辣蓼提取物中、高剂量组大鼠胃组织中SOD活性较模型组明显升高,这表明中、高剂量辣蓼提取物能增强胃黏膜损伤大鼠的抗氧化能力,进而抑制胃黏膜损伤的发生和发展,这可能是其抗胃溃疡的机制之一。Nrf2是氧化应激中抗氧化基因表达的关键转录调控因子,当机体处于氧化应激状态时,可促使Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keapl)解离和释放[14],然后转位进入细胞核,与Maf蛋白形成异二聚体,后者再与抗氧化反应元件(ARE)结合后启动下游抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶基因的表达,从而提高细胞抗氧化应激和解毒的能力[15]。本研究结果表明,辣蓼提取物中、高剂量组大鼠胃组织中Nrf2含量较模型组明显升高,这提示中、高剂量辣蓼提取物可通过提高Nrf2水平,促进下游抗氧化酶基因的表达,增强胃黏膜的抗氧化能力。

综上所述,辣蓼提取物对无水乙醇诱导的大鼠AGML有一定的保护作用,其机制可能与升高胃组织中Nrf2含量和增强SOD活性,促进活性氧的清除,增强胃黏膜的抗氧化能力相关,但其对抗氧化基因表达的影响以及相互关系还有待进一步探讨。

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(收稿日期:2017-10-09 修回日期:2017-11-17)

(編辑:林 静)

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