辣蓼提取物对大鼠急性胃黏膜损伤的保护作用研究

任守忠 苏文琴 朱宏锐 王宁 牛海艳 赵雅媚 马志健

中图分类号 R285；R961 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）07-0955-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.22

摘 要 目的：研究辣蓼提取物对大鼠急性胃黏膜损伤（AGML）的保护作用。方法：将48只大鼠随机分为正常组（生理盐水）、模型组（生理盐水）、阳性组（盐酸雷尼替丁，0.05 g/kg）和辣蓼提取物低、中、高剂量组（以生药量计分别为2.7、8.1、24.3 g/kg），连续灌胃给药7 d，每天1次。末次给药1 h后，除正常组外，其余各组大鼠均灌胃无水乙醇复制AGML模型。造模1.5 h后，计算各组大鼠胃黏膜损伤指数，观察大鼠胃组织病理学变化，采用酶联免疫吸附法测定大鼠胃组织中核因子E2相关因子2（Nrf2）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果：与正常组比较，模型组大鼠胃黏膜损伤明显，黏膜下层毛细血管破裂出血，胃黏膜损伤指数显著升高（P<0.01）；胃组织中 Nrf2含量和SOD 活性显著降低（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠胃黏膜的损伤均不同程度减轻；阳性组和辣蓼提取物中、高剂量组大鼠胃黏膜损伤指数显著降低（P<0.05），胃组织中Nrf2含量和SOD 活性显著升高（P<0.05或P<0.01）。结论：辣蓼提取物对无水乙醇致大鼠AGML具有较好的保护作用，其机制可能与提高胃黏膜组织中Nrf2含量和增强SOD 活性有关。

关键词 辣蓼提取物；急性胃黏膜损伤；核因子E2相关因子2；超氧化物歧化酶；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the protective effects of Polygonum hydropiper extract on acute gastric mucosal lesion （AGML） in rats. METHODS： 48 rats were randomly divided into normal group （normal saline）， model group （normal saline）， positive group （ranitidine hydrochloride， 0.05 g/kg）， P. hydropiper extract low-dose， medium-dose and high-dose groups （2.7， 8.1， 24.3 g/kg by crude drug）， i.g. for consecutive 7 d， once a day. Except for normal group， other groups were given absolute ethyl alcohol to induce AGMI model after 1 h of last administration. 1.5 h after modeling， gastric mucosal lesion index of rats was calculated； the pathological changes of gastric tissue in rats were observed； nuclear factor E2 related factor 2 （Nrf2） content and SOD activity in gastric tissue of rats were determined by ELISA. RESULTS： Compared with normal group， the gastric mucosa of model group was damaged obviously， there was blood capillary rupture in submucosa， gastric mucosal lesion index was increased significantly（P<0.01）； Nrf2 content and SOD activity were significantly decreased in gastric tissue of rats （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， gastric mucosal lesion of rats was relieved to different extent； in positive group， P. hydropiper extract medium-dose and high-dose groups， gastric mucosal lesion index was decreased significantly （P<0.05）， and Nrf2 content and SOD activity were increased significantly（P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： P. hydropiper extract has good protective effect on absolute ethyl alcohol-induce AGMI， the mechanism of which may be associated with raising Nrf2 content and enhancing SOD activity in gastric mucosal tissue.

KEYWORDS Polygonum hydropiper extract； Acute gastric mucosal lesion； Nuclear factor E2 related factor 2； SOD； Rats

辣蓼為蓼科（Polygonaceae）蓼属植物辣蓼（Polygonum hydropiper Linn.）的干燥全草，也称水蓼、蓼芽菜、柳蓼，其味辛、酸，性温，具有祛风利湿、解毒消肿、散瘀止痛、杀虫止痒等功效，主治风湿性关节痛、疥癣、胃肠炎、功能性子宫出血、痢疾、腹泻、脚气和跌打肿痛等[1]，其主要含黄酮和倍半萜和酚酸类成分。药理研究表明，辣蓼具有广谱的抗菌以及抗炎、抗氧化、抗腹泻等作用[2-3]，在临床上用于治疗急、慢性胃肠炎，具有良好疗效。研究表明[4-5]，在急性胃黏膜损伤（AGML）的发生发展过程中氧自由基参与并发挥了重要作用，过量自由基会引起脂质过氧化及共价键结合，从而造成胃黏膜损伤。超氧化物歧化酶（SOD）能清除自由基，减轻过量自由基引起的损伤。核因子E2相关因子2（Nrf2）是调节体内氧化应激状态的关键性因子，其通过激活机体内源性抗氧化应激通路，保护胃黏膜免受氧化应激损害[6]。故本研究旨在观察辣蓼提取物对大鼠AGML的改善作用，并通过考察胃组织中Nrf2含量和SOD活性对其可能的作用机制进行探讨，为防治胃肠疾病中药的研发奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

TP-1200C电子天平（湘仪天平仪器设备有限公司）；TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；DZF- 6020真空干燥箱（上海申贤恒温设备厂）；T25电动匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；MK3酶标仪[赛默飞世尔（上海）仪器有限公司）]；BH-2光学显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 药品与试剂

盐酸雷尼替丁胶囊（石家庄四药有限公司，批号：LN140967，规格：0.15 g/粒）；SOD、Nrf2试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20160428、20160503）；甲醇（广东光华科技股份有限公司，批号：20140919，分析纯）；无水乙醇（西陇化工股份有限公司，批号：15070702，纯度：99.5%）。

1.3 药材

辣蓼于2016年5月采自海南省，经海南医学院药学院曾念开老师鉴定为蓼科蓼属草本植物辣蓼（Polygonum hydropiper Linn.）的干燥全草。

1.4 动物

SD大鼠48只，清洁级， ♀♂各半，体质量（180±20） g，购自长沙市天勤生物技术有限公司[动物生产许可证号：SCXK（湘）2014-0011]。购入后将大鼠饲养于室溫为25～27 ℃的动物房中，饲养期间自由进食饮水，适应性饲养3 d后用于实验。

2 方法

2.1 辣蓼提取物的制备

取辣蓼药材1 kg，粉碎成粗粉，加10倍量水浸泡2 h，然后加热煮沸2 h，滤过，收集滤液；滤渣加8倍量水加热煮沸1.5 h，滤过，收集滤液；滤渣继续加6倍量水加热煮沸1 h，滤过。合并3次滤液，浓缩，即为辣蓼水提液。取一定量辣蓼水提液上AB-8大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗脱，然后用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，即得。

2.2 分组与给药

将48只大鼠按体质量随机分为6组，分别为正常组、模型组、阳性组和辣蓼提取物低、中、高剂量组，每组8只。正常组和模型组大鼠灌胃生理盐水，阳性组大鼠灌胃盐酸雷尼替丁水溶液0.05 g/kg（根据成人临床用量按照换算系数法换算而得），辣蓼提取物低、中、高剂量组大鼠分别灌胃辣蓼提取物（以生药量计分别为2.7、8.1、24.3 g/kg，其中低剂量为成人临床用量按照换算系数法换算而得，各组大鼠均每天给药1次，连续给药7 d。

2.3 AGML模型的制备

末次给药前，各组大鼠均禁食不禁水24 h。末次给药后1 h，除正常组以外，其余各组大鼠均灌胃无水乙醇（1.5 mL/只）诱导AGML[7]。

2.4 胃黏膜膜损伤指数的测定

造模1.5 h后，脱颈处死大鼠，打开腹腔，取出全胃，沿着胃大弯剪开，用生理盐水冲洗胃内容物，吸水纸吸干，将胃平铺于试纸上，置于10倍放大镜下肉眼观察，用游标卡尺测量胃黏膜损伤长度和宽度，分级计分[8]：斑点糜烂≤1 mm，计1分；1 mm<损伤长度≤2 mm，计2分；2 mm<损伤长度≤3 mm，计3分；3 mm<损伤长度≤4 mm，计4分；损伤长度>4 mm，分段计分；宽度≥2 mm则计分加倍。累计得分即为胃黏膜损伤指数。

2.5 胃组织病理形态学的观察

将胃组织置于4%中性福尔马林中固定，石蜡包埋，4 μm切片，苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察大鼠胃组织病理形态学变化。

2.6 胃组织中Nrf2含量和SOD活性的测定

取胃组织用滤纸拭干，称质量，剪碎，放入5 mL离心管中，取9倍量冰生理盐水于离心管中，用组织匀浆机充分研磨制成10%组织匀浆，然后以5 000×g离心10 min，取上清，备用。采用酶联免疫吸附法检测胃组织中Nrf2含量和SOD活性，具体操作按照相应试剂盒说明书进行。

2.7 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行分析。数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 胃黏膜损伤指数测定结果

与正常组比较，模型组大鼠胃黏膜损伤严重，胃黏膜损伤指数明显升高（P<0.01），提示AGML大鼠模型制备成功。与模型组比较，阳性组和辣蓼提取物中、高剂量组大鼠胃黏膜损伤减轻，胃黏膜损伤指数明显降低（P<0.05），结果见表1。

3.2 胃组织病理学观察结果

正常组大鼠胃黏膜层光滑完整、结构层次清晰，黏膜下层及肌层完好。模型组大鼠黏膜破损、不完整，部分腺体被破坏；黏膜下层内毛细血管破裂出血及渗出。辣蓼提取物低剂量组大鼠黏膜表层不完整，部分脱落。阳性组和辣蓼提取物中、高剂量组大鼠黏膜层完整，腺体细胞排列比较整齐；黏膜下层及浆膜层基本完整，各组大鼠胃组织病理学观察结果见图1。

3.3 胃组织中Nrf2含量和SOD活性测定结果

与正常组比较，模型组大鼠胃组织中Nrf2含量和SOD 活性均显著降低（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，辣蓼提取物中、高剂量组大鼠胃组织中Nrf2含量明显升高（P<0.05或P<0.01），阳性组和辣蓼提取物中、高剂量组大鼠胃组织中SOD活性均明显升高（P<0.05或P<0.01），其中以辣蓼提取物高剂量组升高最为显著，结果见表2。

4 讨论

引起胃黏膜损伤的因素众多，主要原因是由于胃黏膜防御因子和损伤因子的平衡消失[9-11]。乙醇是引发胃黏膜损伤的重要攻击因子之一，进入人体后的乙醇大约有20%以上的乙醇在胃部吸收，其能直接损伤胃黏膜和破坏胃黏膜屏障而导致胃黏膜损伤[12]。本研究采用无水乙醇诱导大鼠AGML，研究辣蓼提取物对AGML的防治作用。病理结果显示，模型组大鼠黏膜损伤明显，部分腺体被破坏；黏膜下层内毛细血管破裂出血及渗出。辣蓼提取物中、高剂量组大鼠胃黏膜层基本完整，腺体细胞排列比较整齐，黏膜下层及浆膜层较完好，且胃黏膜损伤指数显著降低，而辣蓼提取物低剂量组大鼠胃黏膜破坏仍明显，部分黏膜腺脱落，这说明中、高剂量辣蓼提取物能明显减轻无水乙醇所致大鼠胃黏膜损伤。

SOD是机体内一种重要的内源性氧自由基清除剂，能有效地清除氧自由基，抑制胃黏膜中的脂质过氧化反应，并能稳定细胞膜，起到保护胃黏膜的作用[13]，故机体内环境中SOD活性的高低可间接性地反映机体清除自由基的能力。由表2结果可知，辣蓼提取物中、高剂量组大鼠胃组织中SOD活性较模型组明显升高，这表明中、高剂量辣蓼提取物能增强胃黏膜损伤大鼠的抗氧化能力，进而抑制胃黏膜损伤的发生和发展，这可能是其抗胃溃疡的机制之一。Nrf2是氧化应激中抗氧化基因表达的关键转录调控因子，当机体处于氧化应激状态时，可促使Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keapl）解离和释放[14]，然后转位进入细胞核，与Maf蛋白形成异二聚体，后者再与抗氧化反应元件（ARE）结合后启动下游抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶基因的表达，从而提高细胞抗氧化应激和解毒的能力[15]。本研究结果表明，辣蓼提取物中、高剂量组大鼠胃组织中Nrf2含量较模型组明显升高，这提示中、高剂量辣蓼提取物可通过提高Nrf2水平，促进下游抗氧化酶基因的表达，增强胃黏膜的抗氧化能力。

综上所述，辣蓼提取物对无水乙醇诱导的大鼠AGML有一定的保护作用，其机制可能与升高胃组织中Nrf2含量和增强SOD活性，促进活性氧的清除，增强胃黏膜的抗氧化能力相关，但其对抗氧化基因表达的影响以及相互关系还有待进一步探讨。

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（收稿日期：2017-10-09 修回日期：2017-11-17）

（編辑：林 静）