二维超高效液相色谱—飞行时间质谱联用技术鉴定氯化琥珀胆碱原料药中的杂质

2018-09-10陈红杨梅张姮婕袁铭廉向金

中国药房 2018年7期

陈红杨梅张姮婕袁铭廉向金

中圖分类号 R954.2；R927 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）07-0941-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.19

摘要目的：建立鉴定氯化琥珀胆碱原料药中杂质的方法。方法：采用二维超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术。一维色谱柱为Hypersil GOLD C18，以缓冲液（含22 mmol/L戊烷磺酸钠+50 mmol/L氯化钠+5 mmol/L硫酸）为流动相A，以乙腈为流动相B，流动相A、B的体积比为95 ∶ 5，柱温为40 ℃，流速为1.0 mL/min，检测波长为214 nm；二维色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18，以0.1%氨水为流动相A，以乙腈为流动相B，采用梯度洗脱，柱温为30 ℃，流速为0.4 mL/min；离子化模式为ESI+，毛细管电压为2.5 kV，离子源温度为120 ℃，雾化气温度为450 ℃，雾化气流速为900 L/h，采集模式为MSE。结果：通过一维液相色谱在氯化琥珀胆碱原料药中检出琥珀酸、琥珀酰氯（工艺中间体）及吡啶（试剂）等杂质；另有4个比较明显的未知杂质，分别命名为杂质1、杂质2、杂质3、杂质4，其中尤以杂质2的表观含量最高。通过二维液相色谱质谱联用法推断杂质2为脱氢琥珀酰单胆碱，杂质4为氯化琥珀酰单胆碱，杂质1、杂质3在质谱中均未被检测到信号。结论：本研究建立了鉴定氯化琥珀胆碱原料药中杂质的方法，其研究结果可用于评价氯化琥珀胆碱原料药的质量。

关键词氯化琥珀胆碱；原料药；杂质；二维超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for the identification of impurities in succinylcholine chloride raw material. METHODS： Two-dimensional UPLC-QTOF-MS was adopted. One dimension chromatographic condition was Hypersil GOLD C18 column using buffer solution （22 mmol/L sodium pentanesulfonate+50 mmol/L sodium chloride+5 mmol/L sulphuric acid） as mobile phase A and acetonitrile as mobile phase B， volume ratio of mobile phase A to mobile phase B 95 ∶ 5， column temperature of 40 ℃， flow rate of 1.0 mL/min， detection wavelength of 214 nm. Two-dimension chromatographic condition was ACQUITY UPLC BEH C18 column using 0.1% ammonia as mobile phase A and acetonitrile as mobile phase B （gradient elution） with column temperature of 30 ℃ at flow rate of 0.4 mL/min. Ionization mode was ESI+ with capillary voltage of 2.5 kV， source temperature of 120 ℃， temperature of atomizing gas at 450 ℃， flow rate of atomizing gas at 900 L/h， acquisition mode of MSE. RESULTS： The succinic acid， succinyl chloride （intermediate）， pyridine （reagent） and other impurities were detected in succinylcholine chloride by one dimensional method of HPLC. Other 4 obvious unknown impurities were named impurity 1， impurity 2， impurity 3 and impurity 4， among which the apparent content of impurity 2 was the highest. Two-dimensional method of HPLC-QTOF-MS deduced that the impurity 2 was dehydrogenate succinylcholine chloride and impurity 4 was succinylcholine chloride. The impurity 1 and impurity 3 were not detected in mass spectrum. CONCLUSIONS： Establish method for the identification of impurity in succinylcholine chloride raw material， and the results of research are used for the evaluation of the quality of the succinylcholine chloride raw material.

KEYWORDS Succinylcholine chloride； Raw material； Impurity； Two-dimensional UPLC-QTOF-MS

氯化琥珀胆碱属于去极化型肌松药。1952年氯化琥珀胆碱注射液被批准在美国上市，1955年氯化琥珀胆碱注射液被批准在日本上市，我国于1959年开始生产氯化琥珀胆碱注射液。氯化琥珀胆碱注射液在临床上用于全身麻醉时气管插管术中维持肌松[1-7]，在现有肌松类药物中起效最快[8]，属于国家基本药物目录（2012年版）品种。氯化琥珀胆碱引起肌纤维去极化时使细胞内钾离子迅速流至细胞外，可致血钾水平升高、肌纤维成束收缩，常见不良反应有术后肌痛及眼压、胃内压、颅内压升高等[9-15]，临床上现已较少使用本品作为全麻快速诱导插管常规用药。鉴于不良反应与药品中杂质存在关系，且2015年版《中国药典》（四部）未收载该原料药杂质的鉴定方法，故本研究拟建立一种对其杂质进行鉴定的方法。

1 材料

1.1 仪器

ACQUITY 2D超高效液相色谱（UPLC）仪、Xevo G2-XS飞行时间质谱（QTOF）仪（美国Waters公司）；AE240电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli2Q去离子水发生器（美国Millipore公司）。

1.2 药品与试剂

氯化琥珀胆碱原料药（A厂，批号：YE151102）；氯化琥珀胆碱[《美国药典》（USP）对照品，批号：L1M438，纯度：以无水物计为98.1%]；琥珀酰单胆碱（USP对照品，批号：H01364，纯度：100%）；戊烷磺酸钠（山东禹王实业有限公司化工分公司，批号：2014091401，色谱纯）；氨水、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 氯化琥珀胆碱概述

氯化琥珀胆碱化学名：二氯化2，2′ -[（1，4-二氧代-1，4-亚丁基）双（氧）]双[N，N，N-三甲基乙铵]二水合物，英文名：Succinylcholine chloride，分子式：C14H30C12N2O4·2H2O，分子量为397.34。氯化琥珀胆碱为白色或类白色的结晶性粉末，无臭，在水中极易溶解，在乙醇或三氯甲烷中微溶，在乙醚中不溶，结构式见图1。

根据氯化琥珀胆碱的理化性质，故参照USP40氯化琥珀胆碱项下有关物质检查法（即“1D法”）的色谱条件对杂质进行初步分析，再采用二维色谱-质谱联用法对其他未知杂质进行分析，结果见图2。

2.2 方法

2.2.1 液相色谱（LC）/UPLC色谱条件（一维法，1D）色谱柱：Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：40 ℃；检测波长：214 nm；流速：1.0 mL/min；流动相A：缓冲液（含22 mmol/L戊烷磺酸钠+50 mmol/L氯化钠+5 mmol/L硫酸），流动相B：乙腈，流动相A、B的体积比为95 ∶ 5。

2.2.2 LC/UPLC色谱条件（二维法，2D）色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：30 ℃；流速：0.4 mL/min；流动相A：0.1%氨水，流动相B：乙腈。洗脱程序：待吡啶杂质2出峰后，B相在3 min内由2%上升到60%。

2.2.3 质谱（MS）条件离子化模式：电喷雾正离子化（ESI+）；毛细管电压：2.5 kV；离子源温度：120 ℃；雾化气温度：450 ℃；雾化气流速：900 L/h；采集模式：全信息串联质谱（MSE）。

2.2.4 样品溶液的制备取氯化琥珀胆碱原料药约100 mg，置于10 mL量瓶中，加乙腈-水（50 ∶ 50，V/V）使溶解并稀释至刻度，摇匀。

2.2.5 测定法取“2.2.4”项下的溶液适量，按“2.2.1”项下方法进样50 μL，待吡啶杂质2出峰后按“2.2.2”项下色谱系统进行分离，同时将多个杂质峰按“2.2.3”项下进行质谱分析和结构确认。

2.3 结果

2.3.1 一维法（1D）实验结果氯化琥珀胆碱为季铵盐，极性很强，在普通反相液相色谱中基本无保留，需在流动相中加入离子对试剂，以增加组分保留，达到更好的分离效果，结果见图2。检出琥珀酸、琥珀酰氯（工艺中间体）及吡啶（试剂）等杂质；另有4个比较明显的未知杂质，分别命名为杂质1、杂质2、杂质3、杂质4，按面积归一化法计算，其中尤以杂质2的表观含量最高。

2.3.2 二维法（2D）与质谱联用实验结果由于“1D”流动相含离子对试剂及不挥发的盐，无法直接与MS连接进行杂质的鉴定，因此使用“2D”UPLC-QTOF系统来完成。考虑到氯化琥珀胆碱及其杂质极性很强，不易在普通色谱柱中保留，因此采用离子对试剂作为流动相（“1D”法），使杂质与主成分基本分离后，再将待测杂质切入“2D”UPLC-QTOF系统进行检测分析。

为找到氯化琥珀胆碱杂质二级质谱的裂解规律，先对主成分氯化琥珀胆碱质谱图进行分析，其一、二级质谱图见图3。二级质谱图中主要碎片离子峰m/z为128.95、145.05、164.92、197.02，氯化琥珀胆碱质谱信号表现为琥珀胆碱部分，即[C14H30N2O4]2+，m/z为145，二级质谱碎片離子解析结果见图4。

杂质4的保留时间约为10 min，分子离子峰m/z为204.123 5，通过软件计算其分子式为[C9H18NO4]+，其一、二级质谱图见图5，二级质谱碎片离子解析结果见图6。结果显示，与氯化琥珀酰单胆碱对照品的质谱图、分子式一致。

有关物质检查表观含量最高的杂质2的一、二级质谱图见图7，二级质谱碎片离子解析结果见图8。

杂质2的分子离子峰m/z为202.107 5，通过软件计算其分子式为[C9H16NO4]+，与氯化琥珀胆碱、氯化琥珀酰单胆碱二级质谱碎片匹配后，推测杂质2可能为脱氢琥珀酰单胆碱，实际在原料药中以氯化物形式存在，结构式见图9。

氯化琥珀酰单胆碱脱氢后共轭结构变长，让杂质2的紫外吸收显著增加，在214 nm波长处进行有关物质检查时表观含量非常大。经SciFinder、Reaxys数据库查询，尚未检索到杂质2的毒理资料。通过对合成路线的分析，推测杂质2可能是由于起始原料丁二酸不纯（丁二酸中所含丁二烯酸参与反应）产生的工艺杂质，而非降解杂质。

3 讨论

氯化琥珀胆碱及其杂质极性很强，不易在普通色谱柱（C18）中保留，因此采用离子对试剂作为流动相，在使用一维色谱条件时，氯化琥珀胆碱及其杂质有较好的色谱保留和分离。由于采用离子对试剂作为流动相，无法直接与MS相连进行杂质的鉴定。因此，使用二维UPLC-QTOF系统来完成，二维色谱使用MS兼容的流动相与QTOF相连，将样品中目标杂质切入二维色谱后再进入MS检测。由于氯化琥珀胆碱及其杂质色谱保留不好，为避免进二维之前样品被洗脱，切峰后未进行脱盐处理全部进入MS。一维色谱的少量离子对试剂进入MS会产生离子抑制。因此，样品中部分本身带电荷的化合物可以被MS检测到，而本身不带电荷的化合物则由于离子抑制可能未被检测到，杂质1、杂质3在MS中均未被检测到信号。

液相系统2D 技术及QTOF系统，可解决不挥发盐液相条件下杂质的定性问题，可以同时检测多个杂质峰。本文主要检测了杂质2和杂质4，分别得到一级和二级MS图，并对其进行了解析，验证了杂质4是氯化琥珀酰单胆碱，推测了杂质2分子式及结构，初步判定杂质2为脱氢氯化琥珀酰单胆碱。

本文采用一维色谱和二维UPLC-QTOF质谱联用技术研究了氯化琥珀胆碱原料药的杂质，研究结果对评价其质量有一定参考意义。

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