胡麻花蕾大小与小孢子发育时期的相关性研究

2018-09-10陈琛罗俊杰王炜

甘肃农业科技 2018年7期

陈琛　罗俊杰　王炜

摘要：为了解小孢子发育时期与花蕾外部形态特征的相互关系，选用2个胡麻品种为试验材料，用改良苯酚品红溶液压片法将5月中旬蕾长为3～8 mm的花蕾制片，在光学显微镜下观察了小孢子发育情况，以分析胡麻小孢子发育时期与花蕾大小之间的关系。结果表明，当花蕾长度为3～4 mm时，小孢子发育基本处在四分体时期； 4～5 mm时，小孢子大部分处于单核中期；5～6 mm时，花药中存在各种发育时期的小孢子，但以单核靠边期为主；当蕾长 > 6 mm时，小孢子开始大量成熟，直至发育为成熟花粉。品种间有差异，但差异较小，基本趋势一致。

关键词：胡麻；小孢子；花药培养；染色

中图分类号：S565.9 文献标志码：A 文章编号：1001-1463（2018）07-0021-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.07.007

Abstract：The study aimed at investigation of the relationship between microspore development period and the morphology of bud of Linum usitatissimum L.. Two cultivars of Linum usitatissimum L. were used as experiment materials， and buds were picked in mid-May， with length between 3～8 mm. The development of microspore was observed under optical microscope， and the relationship between the microspore developmental stages of Linum usitatissimum and the size of buds was analyzed. The results showed that when the buds' length was 3～4 mm， the microspore development was basically in tetrad. When the buds' length was 4～5 mm， the microspores developed into mid-uninucleate. When the buds' length was 5～6 mm， various kinds of developmental stages of microspores could be observed， but most of them were late-uninucleate microspores. When the buds' length exceeded 6 mm， a big scale of microspores entered mature period and turned into pollens. The results in two cultivars were basically consistent， with tiny differences which were not significant.

Key words： Linum usitatissimum L. ；Microspore；Anther culture；Staining

胡麻，即油用亞麻，属亚麻科、亚麻属一年生草本作物，是中国西北、华北和黄土高原等旱作农业地区重要的油料作物之一。我国胡麻育种研究距今已有60余年历史，所用的育种方法有杂交育种、组织培养、分子育种、物理/化学诱变育种等[1 ]。

花药培养作为单倍体育种中应用最成功的方法，能大幅度缩短育种年限、提高育种效率、快速选育新品种。亚麻花药培养的研究始于20世纪70年代，由我国首次培育出亚麻花粉植物[2 ]。植物花药培养过程中，有很多因素对单倍体的诱导效果产生影响，如基因型、花粉发育时期、胁迫处理、激素、培养基及培养条件等[3 ]，只有发育到一定时期的花粉才对离体刺激最敏感，并最终发育成完整植株。因此选择适宜的花粉发育时期对于花药培养成功与否有决定性的作用[4 ]。但是，在大量的花药和小孢子培养过程中，通过显微镜逐个观察取材是很困难和繁琐的。大量研究证明，小孢子发育时期与花蕾外部形态密切相关。例如，油菜的花粉发育时期与花蕾长度有直接关系[5 ]；在红花槐中，花粉发育时期与花蕾纵径，花冠与花萼的长度比等存在相关性[6 ]；白芷的花粉发育时期可根据花药颜色和花瓣颜色直观判断[7 ]。通过花蕾外观形态（蕾长、花瓣颜色等）特征快速、准确地选择适宜的花培材料已被广泛运用在花药培养工作中。有关胡麻花蕾大小与小孢子发育时期关系的研究尚未见报道。我们通过对胡麻不同大小花蕾的花药染色压片，用显微镜观察计数并拍照统计，探讨花蕾外部形态特征与小孢子发育时期的关系，旨在为胡麻花药和小孢子培养提供依据，以提高取材的准确性和效率。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为胡麻杂交种陇亚杂1号、陇亚8号，均由甘肃省农业科学院生物技术研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 采样与测量 3月底将胡麻种子分别播种于大田和温室，田间管理采用常规方法[8 ]。从5月初胡麻花蕾期采样，每天9：00时～10：00时分别在大田和温室采集新鲜、大小不同的花蕾，放入自封口塑料袋内带回实验室。用游标卡尺测量花蕾长度，并按花蕾长度分为五个区间：3～4 mm，4～5 mm，5～6 mm，6～7 mm，7～8 mm。每个区间取5个花蕾，重复3次。用镊子轻轻剥去花蕾萼片和花瓣，取出花药并用游标卡尺测量长度，记录数据并拍照。

1.2.2 压片将花药置于载玻片上，分别用醋酸洋红和改良苯酚品红两种染液染色，滴1滴染色液使其完全浸没，用玻璃棒挤压花药使小孢子散落出来，去掉花药残渣。染色1.5 min后盖上盖玻片，吸去多余染液，在显微镜下观察小孢子发育状况并拍照记录。染色液采用改良的苯酚品红溶液，显微镜为奥林巴斯BX-51。

2 结果与分析

2.1 染色液选择及染色时间

染色液的选择和染色时间对于制片是否成功有重要影响，直接关系到小孢子镜检的效果。通过对比醋酸洋红和改良苯酚品红2种染液后（图1）得出，苯酚品红更适合胡麻游离小孢子染色观察。经醋酸洋红染色的标本背景较混杂，不易区分各发育时期的小孢子。

染色时间不宜过长，容易将所有细胞染成深色不易观察；染色的时间也不能过短，达不到染色的效果。通过试验摸索，染色时间以1.5～2.0 min最为适宜。

2.2 小孢子的发育特征

从图2可以看出，小孢子母细胞经过减数第一次分裂形成的二分体（见图A）。再经过减数第二次分裂形成四分体，呈“田”字形，在显微镜下可以看到小孢子被胼胝质包裹（见图B）；之后小孢子从胼胝质中游离出来分散在花粉囊中，此时细胞核较大居中，即单核居中期（见图C）；随着液泡的逐渐增大，细胞核慢慢向细胞边缘游移，同时萌发孔开始形成，直到细胞核移动至细胞边缘，小孢子具有三个萌发孔（见图D、图E）；小孢子继续发育，细胞核经过2次有丝分裂后形成成熟花粉粒，此时在显微镜下花粉粒颜色变深，看不到细胞器，细胞膨大呈球形（见图F）。

2.3 小孢子各个发育时期与花蕾长度的关系

小孢子的发育时期分为四分体时期、单核早中期、单核靠边期、双核期、三核期5个时期。由于试验条件的限制，双核花粉期和三核花粉期在显微镜下难以区分，其内部特征不是特别明显，因此将这2个时期并归为小孢子发育后期。花药长度、花药颜色及花瓣颜色也随小孢子不同发育时期而变化。

在显微镜下对胡麻杂交种陇亚杂1号不同时期的小孢子进行观察，结果见表1。可以看出，当花蕾长度在3～4 mm时，花蕾中以二分体和四分体小孢子为主，以及少部分散落分布的单核早中期小孢子，此时细胞质颜色浅，细胞核易见；随着花蕾的长度增加，四分体小孢子逐渐减少，单核早中期小孢子数量增多，并且出现少量单核靠边期小孢子。当花蕾长度在5～6 mm时，单核靠边期小孢子数量急剧增加达到峰值，单核早中期小孢子数量减少，同时有一定数量的小孢子进入成熟期。花蕾长度 > 6 mm时，单核早中期和靠边期小孢子减少至消失，视野内以成熟花粉粒为主。

从表2可以看出，陇亚8号小孢子发育时期与蕾长的关系趋势与陇亚杂1号基本一致，但也有部分差别。如四分体小孢子在陇亚杂1号中只在3～4 mm花蕾中大量存在，在4～5 mm的花蕾中鲜见，蕾长至5～6 mm时已经观察不到四分体小孢子。而在陇亚8号中蕾长4～5 mm的花蕾中还以四分体小孢子为主，花蕾长至5 mm之后四分体数量减少至消失。

从图3可以看出，陇亚杂1号各个时期的小孢子数量峰值都分别对应不同的蕾长区间，而陇亚8号中各时期小孢子与蕾长的对应关系不是很分明。

3 结论与讨论

研究结果表明，当花蕾长度为3～4 mm时，小孢子发育基本处在四分体时期；花蕾4～5 mm大小时，小孢子大部分处于单核中期；5～6 mm蕾长的花药中主要以单核靠边期为主；当蕾长 > 6 mm时小孢子开始大量成熟，直至发育为成熟花粉。花药长度和花瓣颜色也随小孢子发育而产生变化。2个品种间有差异，但差异不大，总体趋势一致。该结果有助于进行胡麻花药和小孢子培养的选蕾时提高取材的准确性和效率。

不同植物花药培养的最佳取材时期不同，例如，黄瓜和甘蓝的最佳培养时期是单核靠边期[9 - 10 ]，而大豆的最佳培养时期是单核早、中期[11 ]。对大多数植物而言，单核中晚期是花药和小孢子培养的最佳取材时期，而四分体时期和成熟期的小孢子都很难诱导愈伤组织和胚状体。其原因有两种说法，一是小孢子发育的单核中期至靠边期是胚胎形成的临界期，未到或超过这一发育阶段就难以形成胚状体；另一种说法认为，小孢子发育过程中花药内的激素水平在不断改变，花药成熟时激素水平不再适宜于它的成熟和分裂[12 - 13 ]。胡麻花药培养最佳取材时期还未见报道，这需要通过实验实践进一步探索。

参考文献：

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[3]李守岭，庄南生. 植物花药培养及其影响因素研究进展（综述）[J]. 亚热带植物科学，2006（3）：76-80.

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[11] 尹光初，朱之垠，徐振，等. 大豆花粉植株的诱导及其雄核发育的研究[J]. 大豆科学，1982（1）：69-76.