室内培育不同产地卤虫的成虫肠道菌群结构分析

茹文红　段亚飞　郑晓婷

摘要：【目的】探究室内培育卤虫的成虫肠道菌群组成及结构特征，为开展人工健康养殖卤虫提供参考依据。【方法】选取俄罗斯鄂木斯克地区及我国巴里坤和渤海湾产地的卤虫卵进行孵化，人工养殖至成虫期后采用16S rDNA高通量测序技术分析不同产地卤虫肠道内的菌群组成及结构特征。【结果】Illumina MiSeq测序共得到481096条有效序列，平均每个样品有53455条有效序列。变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）为不同产地卤虫肠道内的优势菌群，其在肠道菌群内的相对丰度均在97.0%以上。不同产地卤虫肠道菌群的共有OTU为291个，共有OTU对应序列数占不同产地卤虫总序列数的95.04%。其中，假单胞杆菌属（Pseudomonas）有29个OTUs，其对应序列数占总序列数的31.25%；盐单胞杆菌属（Halomonas）有15个OTUs，其对应序列数占总序列数的16.44%；交替赤杆菌属（Altererythrobacter）有9个OTUs，其对应序列数占总序列数的12.00%。不同产地的卤虫肠道菌群也存在一定差异，交替赤杆菌属和列文虎克菌属（Leeuwenhoekiella）在俄羅斯鄂木斯克卤虫肠道内的相对丰度显著高于我国巴里坤和渤海湾产地的卤虫（P<0.05，下同），微小杆菌属（Exiguobacterium）在我国巴里坤卤虫肠道内的相对丰度显著高于俄罗斯鄂木斯克地区和我国渤海湾产地的卤虫，而Idiomarina属仅在我国渤海湾卤虫肠道菌群中出现。【结论】卤虫肠道菌群构成与其生存的水体环境和摄食的饵料相关，因此可通过调整养殖水体环境和投喂饵料的一致性以提高肠道共有菌群的比例。卤虫肠道中参与食物消化吸收的有益菌群可作为今后研究卤虫生长机制的靶菌群。

关键词： 卤虫；肠道；菌群结构；不同产地；成虫期

中图分类号： S955.34 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）09-1841-08

0 引言

【研究意义】卤虫（Artemia）别名盐水丰年虫、盐水虾，是一种小型低等水产甲壳类动物，分布在许多碳酸盐和硫酸盐的自然湖泊和人工盐池中，隶属于甲壳纲卤虫属（黄旭雄和陈马康，2000）。卤虫是一种典型的非选择性滤食动物，50 μm以下的颗粒状物质如有机质碎屑、微藻和细菌等均可被摄食（张颖等，2018）。自1933年美国学者Seale发现卤虫无节幼体是仔稚鱼的最佳饵料以来，卤虫在海水养殖生产中即得到广泛应用，其人工养殖技术也不断完善。动物肠道是营养物质消化和吸收的主要场所，而肠道内的微生物是宿主肠道的重要组成部分（Walter et al.，2011；Rungrassamee et al.，2016）。肠道微生物通过影响宿主的免疫、营养吸收及消化而对其健康产生影响（Ley et al.，2008；Roeselers et al.，2011），因此，明确室内培育卤虫肠道的微生物组成对开展人工健康养殖卤虫具有重要意义。【前人研究进展】目前，有关卤虫的研究主要集中在卵生物学特征、人工养殖技术、生长发育、繁殖特性等基础生物学方面。黄玉玲（2004）概述了盐田增殖、盐田养殖、水池养殖和循环流水养殖4种人工增养殖模式，以期为因地制宜开展卤虫人工养殖提供参考；杨志强等（2005）对比6个不同产地的卤虫生物学特性，结果发现干燥卵卵径、去壳卵卵径、吸水卵卵径与无节幼体体长呈显著相关；王素凤（2009）测定了我国7个产地卤虫卵的生物学特征值，发现其卵径和卵颜色与海拔高度密切相关，而卵径与其成体的生殖方式无直接关联；王婧等（2012）研究表明，在春夏季和低盐度环境下孤雌品系卤虫种群占绝对优势，而在秋季和较高盐度下两性生殖卤虫种群逐渐占据优势；Arumugam等（2013）采用不同形式的螺旋藻粉投喂卤虫，结果发现以脂质体包裹的螺旋藻粉最有利于卤虫生长；陈迪虎和刘晓冬（2013）对卤虫在冬季和夏季的孵化和养殖条件进行探索，结果表明，冬季的孵化温度为22～24 ℃、养殖温度为20 ℃，而夏季的孵化温度为30 ℃、养殖温度为24 ℃；李景和徐永健（2013）探讨不同光照强度、温度和盐度对卤虫幼体生长发育的影响，结果表明，最适的光照强度为0.5×103 lx，最适生长温度为26 ℃，最适生长盐度为74.03‰；彭瑞冰等（2013）研究表明，卤虫的最佳饵料组合为三角褐指藻+酵母液；隋丽英和王娇（2014）研究表明，卤虫卵和无节幼体大小与其种群及地理分布密切相关，但营养组成与卤虫种群及地理分布的关联不明显；贺婷婷等（2016）研究发现，在非极端光周期下，艾比湖卤虫的临界光暗时长为8.38±0.37 h，感知光照度处于10～50 lx时卤虫的滞育率较高。【本研究切入点】针对卤虫肠道及肠道微生物的研究，Gunasekara等（2011）通过立体显微镜、光学显微镜和电子显微镜观察不同生长时期卤虫肠道的组成结构，发现卤虫肠道是一个呈钩形的管状结构，包括前肠、中肠和后肠三部分；Motlagh等（2012）研究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和芽孢杆菌（B. licheniformis）对卤虫肠道微生物的影响，结果发现其肠道内芽孢杆菌数量增多，而弧菌数量减少；但至今鲜见采用高通量测序技术研究卤虫肠道微生物结构的相关报道。【拟解决的关键问题】以卤虫（A. parthenogenetica）为研究对象，分别选取俄罗斯鄂木斯克地区及我国巴里坤和渤海湾产地的卤虫卵进行孵化，人工养殖至成虫期后采用16S rDNA高通量测序技术分析不同产地卤虫肠道内的菌群组成及结构特征，以期为开展人工健康养殖卤虫提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

以俄罗斯鄂木斯克地区（LA）及我国巴里坤（LB）和渤海湾（LC）产地的卤虫休眠卵为材料，养殖和孵化用水为盐度30‰、pH 8.3的人工海水，投喂饵料为螺旋藻粉。人工海水是采用广州市海神水族科技服务公司的海水晶与蒸馏水按一定比例混合，曝气2 d，过100目筛绢网后，121 ℃高压灭菌30 min。饵料配制参照Marques等（2006）的方法，螺旋藻粉使用前进行灭菌消毒，再与灭菌人工海水混匀。

1. 2 试验设计

将不同产地休眠卵孵出的卤虫幼体置于1000 mL培养瓶中进行养殖，养殖密度4尾/mL，每个产地卤虫均设3个平行，养殖至卤虫成虫期进行采样。

1. 3 卤虫孵化和养殖

卤虫卵的消毒和孵化参照Baruah等（2011）的方法：取卤虫卵400 mg，用蒸馏水浸泡并曝气1 h。加入32%氢氧化钠（660 ?L）和50%次氯酸钠（10 mL）进行消毒（100 s），加入10 g/L硫代硫酸钠（14 mL）孵育2 min，最后用人工海水洗涤至无色。将消毒脱壳的卤虫卵放入盛有60 mL人工海水的培养瓶中孵化24 h，孵出的卤虫幼虫置于培养瓶中进行养殖。卤虫的孵化和养殖条件：温度30 ℃，盐度30‰，pH 8.3，光照强度2000 lx，全天使用0.22 ?m空气过滤器过滤曝气。养殖期间，每天下午16：00以一次性注射器投喂饵料，投喂量8 mg/L（李信书和彭永兴，2004；Arumugam et al.，2013）；隔天换水1次，每次换水1/2。

1. 4 样品采集处理及生物信息学分析

1. 4. 1 样品采集 根据卤虫的发育分期（赵光平，2014），采集各平行养殖组卤虫成虫（十二令期）100尾。在无菌条件下，利用卤虫的趋光性，以灭菌吸管吸取卤虫个体置于150目网筛中，经无菌海水冲洗后用70%酒精冲洗10 s，最后以灭菌海水冲洗3次（Motlagh et al.，2012；Niu et al.，2012），液氮冷冻处理后-80 ℃保存备用，用于卤虫肠道细菌DNA提取。

1. 4. 2 样品处理 参照Zheng等（2016）的方法提取卤虫肠道细菌DNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，再以TBS380荧光光度计检测DNA浓度、Thermo Scientific微量核酸检测仪检测OD260/OD280。

以通用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGT

AA-3'）和806R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'）扩增细菌16S rDNA的V4～V5区，PCR反应体系25.00 μL，包括5×Reaction Buffer 4.00 μL，5×GC Buffer 5.00 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.00 μL，10 μmol/L正、反引物各1.00 μL，DNA模板2.00 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5High-Fidelity DNA Polymerase 0.25 μL。扩增程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行30个循环；72 ℃延伸5 min。采用2%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，以凝胶回收试剂盒（美国Axygen公司）回收目标片段，并以Quant-iTPico Greends DNA Assay Kit试剂盒进行荧光定量分析。按照测序量需求，对各样本按相应比例进行混合，使用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit建库试剂盒构建测序文库，经Agilent Bioanalyzer质检和Promega QuantiFluor荧光定量分析确定文库合格后，进行Illumina MiSeq测序。

1. 4. 3 生物信息学分析 对Illumina MiSeq测序的原始下机数据根据序列质量进行初步筛查，通过质量筛选的序列按照PCR引物和Barcode信息，识别分配入对应样品，截去Barcode和引物序列，利用FLASH v1.2.7（http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/）对各样品的Reads进行配对连接，获得原始Tags数据（Raw Tags）；然后过滤去除疑问序列和嵌合体序列，以获得有效序列（Effective Tags）。利用QIIME中的UCLUST对获得的高质量有效序列按97.0%的序列相似度进行归并及OTU划分，并选取每个OTU中丰度最高的序列作为其代表序列，在Greengenes数据库（Release 13.8，http：//greengenes.secondgenome.com/）、RDP（Ribosomal Database Project）数据库（Release 11.1，http：//rdp.cme.msu.edu/）或Silva数据库（Release115，http：//www.arb-silva.de）进行搜索比对分析，以获得每个OTU所对应的分类学信息（置信度阈值默认为0.8以上）。利用R软件对OTU各分类等级水平[Kingdom（界）、Phylum（门）、Class（纲）、Order（目）、Family（科）和Genus（属）]的注释比例和物种相对丰度进行统计，绘制OTU级别的Venn图。使用QIIME获取各样本在门、纲、目、科和属分类水平上的组成和丰度分布表，绘制特定样本在特定分类水平的组成柱状图；计算每个样本的Chao1、ACE、Simpson、Shannon等α多样性指数及两种β多样性距离（Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac），并对Unweighted和Weighted的UniFrac距离矩阵分别进行UPGMA聚类分析。

1. 5 统计分析

采用SPSS 17.0对所有试验数据进行统计分析，利用One way-ANOVA对统计结果进行单因素方差分析，并以Duncans多重比较检验组间差异显著性。

2 结果与分析

2. 1 Illumina MiSeq测序结果

9个肠道细菌样品经Illumina MiSeq测序及质量筛查后共得到481096条有效序列，平均每个样品有53455条有效序列。序列长度主要分布在391～395 bp，平均为393 bp。3个产地分别获得663～996个不同的OTUs。由基于97.0%相似性水平划分的OTUs稀釋曲线（图1）可知，各样品的有效序列在40000条以上时，OTUs稀释曲线趋于平缓，表明样品的序列测序数量可有效覆盖测序文库。

采用Chao1、ACE、Simpson、Shannon等α多样性指数评估3个不同产地卤虫肠道菌群的丰富度及多样性，结果（表1）表明，LC组的Chao1指数及ACE指数均显著高于LA组（P<0.05，下同），LB组的Chao1指数和ACE指数高于LA组但低于LC组，且与LC组或LA组间均无显著差异（P>0.05，下同）。在Simpson指数方面，3个产地间无显著差异，维持在0.81～0.88。3个产地的卤虫以LB组的Shannon指数最高（4.20），显著高于LA组（3.46），但与LC组间无显著差异。

2. 2 卤虫肠道菌群结构组成

在门分类水平上，3个产地卤虫肠道样品共检测到8个不同门类（图2）。其中，变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）为不同产地卤虫肠道内的优势菌群，其在肠道菌群内的相对丰度均在97.0%以上，且不同产地间无显著差异。卤虫肠道内菌群数量占绝对优势的门为变形菌门。对于放线菌门（Actinobacteria），LB组的相对丰度（2.3%）与LA组（0.3%）和LC组（0.6%）间存在显著差异；异常球—栖热菌门（Deinococcus-Thermus）和酸杆菌门（Acidobacteria）以很低的豐度（相对丰度≤0.3%）被检出；浮霉菌门（Planctomycetes）仅在LC组中检测到，相对丰度为0.1%；而螺旋体门（Spirochaetae）仅在LA组中检测到，相对丰度为0.2%。

在属分类水平上，不同产地卤虫肠道样品共检测到23个不同菌属（相对丰度≥0.1%）。在LA组中，相对丰度占比较高的4个菌属分别是假单胞杆菌属（Pseudomonas）、盐单胞杆菌属（Halomonas）、交替赤杆菌属（Altererythrobacter）和列文虎克菌属（Leeuwenhoekiella）；在LB组和LC组中，相对丰度占比较高的4个菌属均为假单胞杆菌属、盐单胞杆菌属、交替赤杆菌属和副球菌属（Paracoccus）（图3）。假单胞杆菌属是3个产地卤虫肠道中的最优菌群，相对丰度分别为27.0%、24.2%和32.3%；盐单胞杆菌属在不同产地卤虫间无显著差异；交替赤杆菌属和列文虎克菌属均表现为LA组的相对丰度显著高于LB组和LC组；而微小杆菌属（Exiguobacterium）表现为LB组的相对丰度显著高于LA组和LC组；Idiomarina属仅在LC组卤虫肠道菌群中出现，相对丰度为4.2%。

2. 3 卤虫肠道共有菌群

根据不同产地卤虫样品的全部有效OTU绘制Venn图。由图4可知，有效的OTU共有2363个，不同产地卤虫样品的共有OTU为291个，共有OTU对应序列数占不同产地卤虫总序列数的95.04%。图5是共有OTU对应的菌群组成。其中，有29个OTUs对应的是假单胞杆菌属，其对应序列数占总序列数的31.25%；有15个OTUs对应的是盐单胞杆菌属，其对应序列数占总序列数的16.44%；有9个OTUs对应的是交替赤杆菌属，其对应序列数占总序列数的12.00%；有5个OTUs对应的是副球菌属，其对应序列数占总序列数的9.42%；有49个OTUs对应的是在属水平没有分类，其对应序列数占总序列数的3.19%。

3 讨论

肠道微生物包含有益菌和有害菌，其中，有益菌对宿主免疫应答、营养吸收、内环境稳定等生理过程起积极的调节作用，而有害菌会导致黏膜层渗透性增加，使细菌或食物中的大分子穿过黏膜屏障，对宿主造成危害（陈忠龙和吴小南，2007；Shen，2009；Roeselers et al.，2011）。目前，对于肠道微生物的研究通常采用培养技术和分子技术。由于一些微生物很难在实验室条件下培养（Kim et al.，2007），导致采用培养技术研究肠道微生物存在很大的局限性。即使采用DGGE、PCR等分子技术研究肠道微生物，也只能检测到占主导地位的微生物，而导致微生物多样性缺失（Roeselers et al.，2011；Najdegerami et al.，2012；Wu et al.，2012）。高通量测序技术是利用序列标签高效处理样品，深入分析微生物群落，更清楚地了解微生物物种的个体数量及其丰富度（Hamady et al.，2008；李存玉等，2015），现已广泛应用到鱼、虾等水产动物肠道微生物研究领域（Tzeng et al.，2015；刘增新等，2017）。

共有菌群是指一个物种所有个体共同拥有的微生物群落（Wong et al.，2013），共同菌群的形成可能是宿主与肠道细菌之间共同进化的结果（Huang et al.，2016）。本研究采用高通量测序技术对3种不同产地卤虫成虫肠道菌群结构进行分析，结果表明，3种卤虫的肠道菌群很相似，存在共有菌群，且共有菌群序列数所占比例高达95.04%，与Li等（2015）的研究结果一致，即同一养殖池内3种不同鱼类共有的肠道菌群序列数分别占对应鱼类肠道微生物总序列数的74.84%、88.91%和64.43%，但与Liu等（2016）对梁子湖内野生淡水鱼肠道菌群的研究结果不一致，各种淡水鱼共有的肠道菌群序列数所占比例较低，分别为33.20%、26.40%和29.04%。其原因可能是饵料和环境会影响宿主的肠道微生物，相同的饵料及饲养环境增加了共有微生物的比例（Roeselers et al.，2011）。由此推测，本研究检测到的共有菌群并非卤虫肠道所拥有的共有菌群，因此需进一步比较野生卤虫及不同养殖方式卤虫的肠道菌群。

本研究发现不同产地卤虫肠道内的最优菌群均为变形菌门，与鱼、虾类肠道微生物的研究结果（王海清，2010；郑晓婷，2016）一致。变形菌门是细菌中最大的门类，其包含大量代谢化合物的细菌（Cottrell and Kirchman，2000）。在本研究的共有菌群中，占比较高的两个菌属（假单胞杆菌属和盐单胞杆菌属）均属于变形菌门。其中，假单胞杆菌属能分泌一些蛋白酶，消化利用高蛋白（Balcázar et al.，2006；Ninawe and Selvin，2009）；而盐单胞杆菌能降解脂肪酸和碳水化合物（Zhang et al.，2009；Barikani et al.，2014）。宿主食物的消化和吸收均依赖于肠道内微生物，而肠道内微生物可分泌一些酶以消化食物并将能量提供给宿主（Ray et al.，2012）。因此推测，假单胞杆菌属和盐单胞杆菌属所占比例较高与本研究投喂螺旋藻粉有关，两种菌属的存在有利于卤虫肠道消化利用螺旋藻粉。

本研究發现3种不同产地卤虫的肠道菌群也存在一些差异。Idiomarina属仅在我国渤海湾（LC组）卤虫肠道菌群中出现，微小杆菌属在我国巴里坤（LB组）卤虫肠道内的相对丰度显著高于俄罗斯鄂木斯克地区（LA）和我国渤海湾（LC）产地的卤虫。其原因可能与卤虫卵的产地有关，俄罗斯鄂木斯克地区和我国巴里坤地区远离海洋，而渤海湾位于我国的近海地区。交替赤杆菌属和列文虎克菌属则表现为LA组的相对丰度显著高于LB组和LC组，但至今鲜见有关交替赤杆菌属和列文虎克菌属存在地域差异的研究报道，因此尚需进一步探究验证。

4 结论

卤虫肠道菌群构成与其生存的水体环境和摄食的饵料相关，因此可通过调整养殖水体环境和投喂饵料的一致性以提高肠道共有菌群的比例。卤虫肠道中参与食物消化吸收的有益菌群可作为今后研究卤虫生长机制的靶菌群。

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（責任编辑 兰宗宝）