基于高通量测序的橡胶林土壤真菌多样性及群落组成分析

周玉杰　李建华　张广宇　王宁　 谭文丽　王永鹏　王春燕　王华锋

摘要：【目的】分析不同林龄橡胶林中土壤真菌的多样性及群落组成，为橡胶林土壤生态系统的健康发展和可持续利用提供参考依据。【方法】采用高通量测序技术测定海南大丰农场不同林龄（5、10、13、18、25和30年生）橡胶林中土壤真菌的ITS序列，观测真菌多样性和群落组成随种植年限的变化情况，并分析其与土壤环境因子的关系。【结果】从6个林龄橡胶林的18份土壤样本中获得563658条ITS序列，在97%序列相似性基础上可划分为10943个可操作分类单元（OTU）。真菌群落的丰富度指数（Ace和Chao1）以25年生橡胶林最低，而多样性指数（Shannon-wienner和Simpson）在不同林龄橡胶林间差异不明显。Ascomycota（子囊菌门）、Zygomycota（接合菌门）和Basidiomycota（担子菌门）是海南大丰农场橡胶林土壤真菌的主要优势类群；不同林龄橡胶林间的真菌群落组成差异主要体现在Zygomycota、Basidiomycota、Glomeromycota（球囊菌门）和Rozellomycota类群相对丰度的不同。冗余分析（RDA）结果表明，橡胶林的土壤真菌多样性与土壤养分含量（尤其是钾元素含量）密切相关。【结论】高通量测序技术测定的不同林龄橡胶林间土壤真菌群落多样性无明显差异，而真菌群落丰度以25年生橡胶林最低，5、10、13、18和30年生橡胶林间差异不明显；真菌群落组成的优势类群为子囊菌门、接合菌门和担子菌门；土壤养分含量（尤其是钾元素含量）是影响橡胶林土壤真菌多样性的重要因素。

关键词： 橡胶林；高通量测序；土壤真菌；多样性

中图分类号： S794.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）09-1729-07

0 引言

【研究意义】我国从19世纪50年代开始大规模引种橡胶树（Hevea brasiliensis），目前已形成以海南、云南和广东为主的三大天然橡胶优势种植区域，其中海南省橡胶树种植面积占全省植被总面积的25%（王纪坤等，2012）。橡胶林是典型的人工林生态系统，长期大规模的替代自然植被，且伴随着干扰、施肥和土地清理等人类活动，对土壤真菌产生了负面影响（Zhang and Zhang，2003；楊帆，2016；Kerfahi et al.，2016）。近年来，迅速发展的高通量测序技术具有更高的分辨率，为更准确地揭示橡胶林土壤真菌多样性及群落组成的变化提供了条件。因此，采用高通量测序技术测定橡胶林土壤真菌的多样性及群落组成，对橡胶林土壤生态系统的可持续利用具有重要意义。【前人研究进展】高秀兵和李增平（2010）的研究结果表明，海南橡胶种植园土壤的丛枝菌根真菌分属于5个属31个种，其中球囊霉属（Glomus）是最高属类群。Osemwegie（2010）、Zhang等（2013）研究发现，橡胶林的土壤真菌多样性低于周围天然林。李君等（2016）研究发现，橡胶林土壤真菌类群的数量低于细菌和放线菌。Lin等（2012）研究认为，真菌群落可作为土壤质量的一个指标衡量橡胶林管理措施对土壤的影响程度，而以往对橡胶林土壤微生物的研究主要集中于土壤细菌群落（杨帆，2016；Kerfahi et al.，2016；Lan et al.，2017），采用的技术分辨率较低，如宋风雅等（2014）采用PCR/T-RFLP技术可分析橡胶林不同土壤深度的真菌区系，但无法获得真菌的具体分类信息。【本研究切入点】目前，采用高通量测序技术测定不同林龄橡胶林中土壤真菌多样性及群落组成的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】采用高通量测序技术测定海南省琼中县大丰农场不同林龄橡胶林土壤中的真菌群落及组成的多样性，并分析不同土壤环境因子对其的影响，以期为橡胶林土壤生态系统的健康发展和可持续利用提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 研究区概况

研究区位于海南省琼中县大丰农场（东经19°14′～19°16′、北纬109°44′～109°45′、海拔175～207 m）。该区域为热带海洋季风气候，年均温度22.8 ℃，最冷月平均气温16～18 ℃，年均相对湿度85%，年均降水量2278 mm。选取6个不同林龄（5、10、13、18、25和30年生）常规栽培的橡胶林林地为试验样地，每个样地面积1.0 ha。橡胶树栽培品系为PR107，株行距3.0 m×7.0 m。各样地的立地条件、栽培管理措施和割胶制度基本一致。土壤类型为砖红壤。

1. 2 土壤样品采集

2016年5月在单个样地内选取15个采样点，采集0～20 cm土层土壤，将每5个点采集的土样混合，每个林龄橡胶林取3份混合土样，共18个土壤样本。剔除植物根系和石块后每份混合土样分为两份，一份带回实验室经风干后研磨，过2 mm尼龙筛，混匀，用于土壤理化性质分析；另一份置于-80 ℃冰箱保存，用于DNA提取。

1. 3 土壤性质测定

根据中国林业行业标准LY/T 1210 1275—1999《森林土壤分析方法》（国家林业局，1999），土壤pH采用pH酸度计测定，有机质（SOM）含量采用重铬酸钾氧化容量法测定，全氮（TN）含量采用半微量凯氏法测定，全磷（TP）含量采用钼锑抗分光光度法测定，全钾（TK）含量采用原子吸收分光光度法测定，碱解氮（AN）含量采用碱解扩散法测定，有效磷（AP）含量以NH4F-HCl溶液提取后采用紫外可见分光光度计测定，速效钾（AK）含量采用1.0 mol/L乙酸铵浸提后以火焰光度计测定。

1. 4 高通量测序

土壤样品送至美吉生物医药科技（上海）有限公司进行DNA提取和高通量测序。参照Schloss等（2009）的方法对获得的原始序列进行质量控制和过滤，得到优化序列。在97%序列相似性基础上将优化序列划分为可操作分类单元（OTU）。在OTU水平上计算覆盖度指数（Coverage）、丰富度指数（Chao1和Ace）和多样性指数（Shannon-wienner和Simpson）。对比UNITE （Release 7.0 http：//unite.ut.ee/index.php）数据库，使用BLAST对97%相似水平的OTU代表序列进行注释，并在门和纲分类水平上统计群落组成。

1. 5 统计分析

试验数据采用DPS 7.05进行方差分析；采用Canoco 4.5进行真菌群落多样性指数与土壤性质各因子的冗余分析（RDA）；在门分类水平上计算各真菌类群的OTU与土壤性质各因子的Pearson相关系数，并基于Bray-Curtis距离进行聚类分析。

2 结果与分析

2. 1 不同林龄橡胶林的土壤性质

由表1可知，5和10年生橡胶林的土壤pH较高，二者间差异不显著（P>0.05，下同），但极显著高于其他林龄橡胶林（P<0.01，下同），18年生橡胶林的土壤pH极显著高于13、25和30年生橡胶林，13、18和30年生橡胶林的土壤pH极显著高于25年生橡胶林。不同林龄橡胶林样地土壤pH均小于5.00，呈酸性，且以5和10年生橡胶林样地土壤的酸性相对较弱。

土壤有机质和全氮含量以5、25和30年生橡胶林较高，10、13和18年生橡胶林较低；全钾含量以30年生橡胶林最高，10和13年生橡胶林较低，5、18和25年生橡胶林间差异不显著；各林龄橡胶林间的土壤全磷含量差异不显著；碱解氮含量以10年生橡胶林最低，且极显著低于其他林龄橡胶林；有效磷含量以25年生橡胶林最高，10年生橡胶林最低，5、13、18和30年生橡胶林间差异不显著；速效钾含量以25和30年生橡胶林较高，其次为5年生橡胶林，13和18年生橡胶林间差异不显著。说明不同林龄橡胶林的土壤养分存在明显差异，其中以10和13年生橡胶林的土壤养分含量相对较低。

2. 2 不同林龄橡胶林土壤真菌群落丰度及多样性

由表2可知，从6个林龄橡胶林18份土壤样品中共获得563658条高质量的ITS序列，在97%序列相似性基础上可划分为10943个OTUs。各林龄橡胶林土壤真菌的Coverage指数介于0.9914～0.9940，说明测序数据量合理，测序数据基本涵盖了橡胶林土壤中所有的真菌类群，能体现橡胶林真实土壤环境中真菌的特征。Coverage 指数以13年生橡胶林最高，显著高于18和30年生橡胶林，5、10、18和25年生橡胶林间的Coverage 指数差异不显著，但均明显高于30年生橡胶林。Ace指数介于601～824，Chao1指数介于598～815，Shannon-wienner指数介于3.77～4.40，Simpson指数介于0.035～0.098。其中，Ace指数和Chao1指数均以25年生橡胶林最低，且极显著低于30年生橡胶林；5、10、13、18和30年生橡胶林间的Ace指数和Chao1指数差异不显著；不同林龄橡胶林土壤真菌群落的Shannon-wienner和Simpson指数差异不显著。综上所述，以25年生橡胶林的土壤真菌丰度最低，而5、10、13、18和30年生橡胶林间的土壤真菌丰度差异不明显；橡胶林土壤真菌的多样性在不同林龄间无明显差异。

2. 3 不同林龄橡胶林的土壤真菌群落组成

2. 3. 1 橡胶林土壤真菌群落的基本组成 由图1可看出，海南大丰农场橡胶林的土壤真菌群落66.15%隶属于6个门，分别为Ascomycota（子囊菌门）、Zygomycota（接合菌门）、Basidiomycota（担子菌门）、Rozellomycota、Glomeromycota（球囊菌门）和Chytridiomycota（壶门菌门）。其中Ascomycota的相对丰度为44.01%，Zygomycota和Basidiomycota作为土壤真菌群落组成的主要类群，相对丰度分别为12.51%和9.23%，占整个真菌群落的65.75%。

从图2可看出，在纲分类水平上，海南大丰农场橡胶林土壤真菌群落隶属于25个纲，分别为Ascomycota unclassified（子囊菌门未分类纲）、Sordariomycetes（粪壳菌纲）、Zygomycota incertae sedis（接合菌门未命名纲）、Agaricomycetes（伞菌纲）、Tremellomycetes（银耳纲）、Dothideomycetes（座囊菌纲）、Eurotiomycetes（散囊菌纲）、Ascomycota incertae sedis（子囊菌门未命名纲）、Leotiomycetes（锤舌菌纲）、Archaeorhizomycetes（古菌根菌纲）、Basidiomycota unclassified（担子菌门未分类纲）、Rozellomycota unidentified、Glomeromycetes（球囊菌纲）、Pezizomycetes（盘菌纲）、Chytridiomycetes（壶菌纲）、Orbiliomycetes（圆盘菌纲）、Saccharomycetes（酵母菌纲）、Wallemiomycetes（节担菌纲）、Microbotryomycetes（微球黑粉菌纲）、Basidiomycota incertae sedis（担子菌门未命名纲）、Atractiellomycetes、Chytridiomycota unclassified（壶菌门未分类纲）、Exobasidiomycetes（外担菌纲）、Ustilaginomycetes（黑粉菌纲）和Geoglossomycetes。其中前8个纲的相对丰度均大于2.00%，分別隶属于Ascomycota、Zygomycota和Basidiomycota 3个真菌门。

2. 3. 2 不同林龄橡胶林土壤真菌群落组成的变化

由表3可知，在门分类水平上，5～30年生橡胶林间Ascomycota和Chytridiomycota的相对丰度无显著差异；13年生橡胶林Zygomycota的相对丰度显著高于5和25年生橡胶林，其他橡胶林间的相对丰度差异不显著；10年生橡胶林Basidiomycota的相对丰度最高，显著高于5和18年生橡胶林，而5、13、18、25和30年生橡胶林间的相对丰度差异不显著；Glomeromycota的相对丰度以5年生橡胶林最高，极显著高于10～30年生橡胶林，18年生橡胶林未发现Glomeromycota，10、13、25和30年生橡胶林间的相对丰度差异不显著；25年生橡胶林Rozellomycota的相对丰度极显著高于其他林龄橡胶树，13和18年生橡胶林未发现Rozellomycota。可见，在门分类水平上，不同林龄橡胶林的土壤真菌群落组成差异主要体现在Zygomycota、Basidiomycota、Glomeromycota和Rozellomycota 4个门类群相对丰度的不同。

2. 4 不同林龄橡胶林土壤真菌群落与土壤性质的相关性

RDA分析结果（图3）表明，橡胶林土壤真菌群落的Ace指数、Chao1指数和Shannon-wienner指数与全钾、有机质、全氮、速效钾及有效磷含量呈正相关（其中与全钾含量呈极显著正相关，与速效钾含量呈显著正相关），而与pH和全磷含量呈负相关；Simpson指数与全钾、有机质、全氮、速效钾和有效磷含量呈负相关，与pH和全磷含量呈正相关。说明橡胶林土壤真菌偏好酸性土壤，且其丰度和多样性与土壤养分含量密切相关，尤其与钾元素含量相关更密切。

在门分类水平上，Zygomycota与速效钾、全磷和有机质含量呈显著负相关；Basidiomycota与碱解氮、全钾、全氮和有机质含量呈显著负相关；Ascomycota与速效钾含量呈显著负相关，与pH呈显著正相关；Rozellomycota与速效钾和全磷含量呈显著正相关。说明橡胶林土壤中不同真菌类群与营养元素含量的相互关系存在差异。

从图4可看出，根据各真菌门OTU与土壤性质各因子的关系，可将橡胶林土壤真菌群落分为四大类，其中，Zygomycota和Basidiomycota归为一类，Ascomycota和Chytridiomycota归为一类，Glomeromycota单独为一类，Fungi unclassified和Rozellomycota归为一类。说明橡胶林土壤中不同真菌类群与土壤环境因子的相互关系既有相似性又存在差异。

3 讨论

本研究采用高通量测序技术详细分析了橡胶林土壤真菌多样性及其群落组成，结果表明，橡胶林土壤真菌群落在门分类水平上的优势类群为子囊菌门，其次为接合菌门和担子菌门，与Frey等（2004）、Curlevski等（2010）、Wu等（2013）的研究结果相似。Frey等（2004）研究认为，子囊菌门和接合菌门真菌多数为腐生菌，对分解植物残体和降解土壤有机质具有重要作用，而担子菌分解木质纤维素的能力较强。Curlevski等（2010）研究发现，澳大利亚亚热带森林土壤中的子囊菌门真菌群落多于担子菌门和接合菌门。Wu等（2013）研究认为，中国亚热带森林土壤的真菌群落主要是担子菌门、子囊菌门和接合菌门。子囊菌门、接合菌门和担子菌门是橡胶林土壤真菌群落中的主要菌群，可能与橡胶林林下存在大量凋落物需要分解有关。董爱荣等（2004）、李海涛等（2010）研究认为，凋落物是土壤微生物摄取营养和能量的来源，凋落物的丰富程度和品质高低直接决定微生物的数量及群落结构；真菌是生态系统中重要的分解者，对难以分解的纤维素和木质素，主要依赖于真菌的作用。

已有研究认为，在森林生态系统中，土壤真菌多样性和群落组成受多种因素影响，如土壤环境（Dickie et al.，2002）、植物多样性（Sun et al.，2016）和林龄（Zhu et al.，2010），而多数橡胶林土壤质量较差，其土壤真菌多样性低于周围的天然林（Osemwegie，2010；Zhang et al.，2013），不同林龄橡胶林土壤性质和养分含量的变化可能会影响土壤微生物群落的多样性及其组成（Herrmann et al.，2016）。本研究的RDA分析结果表明，橡胶林土壤真菌群落的丰度和多样性与有机质、全氮、全钾、速效钾和碱解氮含量呈正相关，说明土壤养分是影响橡胶林土壤真菌的重要因素，与Guo等（2013）、Lan等（2017）的研究结果相似。此外，橡胶林土壤真菌群落的丰度和多样性与钾元素含量密切正相关，可能与真菌对钾具有活化作用有关，外生菌根真菌可不同程度地活化土壤钾（张亮等，2014）。常强强等（2017）的研究结果也表明，青檀根际土壤真菌多数OTU与速效钾含量呈正相关。

4 结论

高通量测序技术能全面反映海南大丰农场橡胶林土壤中的真菌群落状况。不同林龄橡胶林间土壤真菌群落的多样性无明显差异；而真菌群落丰度以25年生橡胶林最低，5、10、13、18和30年生橡胶林间差异不明显。真菌群落组成的优势类群为子囊菌门、接合菌门和担子菌门。土壤养分含量（尤其是钾元素含量）是影响橡胶林土壤真菌多样性的重要因素。

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（責任编辑 思利华）