白及小分子热激蛋白BsHsp17.3基因的克隆与表达分析

江爱明 蔡高磊 曹俊 周向宇 柯尊伟

摘 要： 为了探索人工栽培白及的适宜条件，该研究以湖北省十堰市野生白及为对象，采用同源克隆和3′RACE技术，从白及（Bletilla striata ）中获得与热激蛋白合成有关的BsHsp17.3基因，并分析BsHsp17.3基因对不同胁迫的响应。结果表明：BsHsp17.3基因开放阅读框长度为453 bp，编码150个氨基酸；蛋白的分子量为17.42 kD，等电点为6.33。进化树分析表明BsHSP17.3蛋白与同为兰科的铁皮石斛进化关系较近，同在一分支上。半定量RT-PCR分析显示BsHsp17.3基因在白及根、叶、鳞茎及花组织中的表达具有特异性，且BsHsp17.3基因在叶中的表达量较高，在鳞茎及花中不表达。实时荧光定量PCR检测显示BsHsp17.3对非生物胁迫高温、低温具有明显应答反应，20%PEG模拟干旱胁迫不诱导该基因表达，推测该基因在白及防止倒苗过程中可能发挥一定作用。

关键词： 白及， BsHsp17.3， 克隆， 荧光定量PCR

中图分类号： Q943.2 文献标识码： A 文章编号： 1000-3142（2018）09-1191-08

Abstract： BsHsp17.3 gene was isolated from Bletilla striata using homologous cloning and 3′RACE methods. In this study， the expression profiles of BsHsp17.3 under different stresses were analyzed and suitable conditions were explored for artificial cultivation of B. striata. The results were as follows： The opening reading frame of BsHsp17.3 was 453 bp， which encoded a 150-amino acid peptide. Its protein molecular weight and isoelectric point were 17.42 kD and 6.33. Phylogenetic analysis demonstrated that BsHsp17.3 was closed to the Hsp17.3 from Dendrobium catenatum. Quantitative real-time PCR analysis showed that the expression of BsHsp17.3 was different in leaf， root， bulb and flower of B. striata. The expression level of BsHsp17.3 gene was the highest in leaf and root，respectively， but was absent from the bulb and flower. The expression of BsHsp17.3 was analyzed by quantity RT-PCR under cold， hot and drought treatments. The results showed that the expression of BsHsp17.3 quickly induced by high temperature and cold， but drought stress simulated by 20% PEG did not regulate the gene expression. These results suggest that BsHsp17.3 may be involved in regulating sprout tumble of Bletilla striata.

Key words： Bletilla striata， BsHsp17.3， clone， quantity RT-PCR

白及（Bletilla striata），為多年生草本球根植物，植株高18～60 cm，叶呈狭长圆形或披针形，花大色艳，种子极细小，似粉末，没有胚乳。假鳞茎扁球形，肥厚肉质，数个相接可入药，有收敛止血、清热解毒、消肿生肌之功效，具有较高的药用价值和观赏价值。白及耐阴惧晒，常生长于较湿润的石壁、苔藓层中，与灌木相结合。每年6—9月、12月至次年1月，温度较高和较低，白及地上部分植株枯萎、倒伏，进行倒苗，这是白及抵御高温和低温一种适应性表现。但是，倒苗缩短了白及的生长期，严重影响了白及的产量， 因此防倒苗是一项非常重要的增产措施（黎君等，2016）。

在高温胁迫下，植物细胞中的各种酶因变性丧失功能。为了消除高温胁迫所造成的伤害，植物细胞内具有对损伤蛋白进行修复和清除的机制（Bouchard，1990；Guo et al，2015）。其中，热激蛋白（heat shock protein，HSP）是细胞在高温胁迫下产生的一类蛋白质，它主要作为分子伴侣，辅助蛋白质正确折叠和运输，维持蛋白的构象和功能稳定（Pegoraro et al，2011；Sarkar et al，2009）。根据分子量大小可将植物热激蛋白分成HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和小分子量热激蛋白。小分子热激蛋白的分子量在12～45 kD之间，也是保守性最低的一类热激蛋白（Sun et al，2001，2002；Yang et al，2017）。研究发现小分子热激蛋白基因在种子发育过程中受高温和渗透胁迫诱导表达，超表达该基因能增强植物对干旱、高温、盐和UV-B 的抗性（Sun et al，2001；Zou et al，2012；孙爱清等，2015）。本研究以湖北省十堰市野生白及为研究对象，克隆小分子热激蛋白基因BsHsp17.3，并对其组织特异性及生长过程中主要面临的3种不同胁迫条件进行处理，通过实时荧光定量PCR检测该基因的表达情况，为白及人工栽培温度调控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

野生白及种子采自湖北省十堰市境内，地理位置为110°85′ E、32°97′ N，海拔315.6～352.2 m，将采集的新鲜种子消毒灭菌后直播于培养基上进行萌发，将5月龄白及植株驯化移栽于汉江师范学院生化系人工气候室。

1.2 方法

1.2.1 白及逆境胁迫处理 对5叶龄白及植株分别进行0 ℃、35 ℃， 20%PEG模拟干旱胁迫处理0、0.5、2、8、12 h，胁迫处理结束后取植株的完全展开叶片，于液氮中保存，用于基因表达特性分析。

1.2.2 RNA提取与cDNA合成 剪取生长健康的叶片用于叶片总RNA提取（TRIzol法），反转录成cDNA，用于克隆BsHsp17.3基因。

1.2.3 BsHsp17.3基因的克隆 根据NCBI数据库中已公布的烟草Hsp17.3基因（LOC107832104）序列设计上游引物Hsp17.3-F和下游引物Hsp17.3-R，以总RNA为模板，按照 PrimeScriptTM Double Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa Code No.6111A）的操作说明合成cDNA。PCR反应体系为20 μL，包括1 μL cDNA模板，0.2 μL Pyrobest DNA Polymerase， F Primer（20 μmol·L-1）0.15 μL， R Primer（20 μmol·L-1）0.15 μL，10×Pyrobest Buffer II 2 μL，dNTP Mixture 0.2 μL，dH2O 16.3 μL。反应程序为98 ℃预变性2 min，30个循环（98 ℃、10 s，60 ℃、15 s，68 ℃、30 s），扩增产物回收后测序。

采用3′-full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒（TaKaRa Code No.6106），利用3′RACE Outer Primer和3′RACE Inner Primer扩增出完整的BsHsp17.3基因。用含有Gold view的1.5%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。回收后的PCR产物连接到pMDTM18-T载体上，委托Takara进行DNA测序。所用引物见表1。

1.2.4 BsHsp17.3基因的序列比对及系统发育分析 采用BioXM2.6软件对BsHsp17.3基因的可阅读框长度进行預测，并翻译成对应的氨基酸序列；用在线软件SWISS-MODEL分析蛋白质相对分子量、等电点和结构域；利用NCBI数据库中的BLAST进行同源序列分析；采用DNAMAN软件对BsHSP17.3氨基酸序列进行多重比对；选取来源于19个不同植物的HSP17.3蛋白（表2），采用MEGA5软件的邻接法（NJ）构建蛋白质序列系统发育树，并编辑成图。

1.2.5 BsHsp17.3基因组织特异表达分析 利用Trizol法分别提取白及的根、鳞茎、叶、花组织总RNA，并反转录成cDNA，方法见 BsHsp17.3基因的克隆。以白及28sRNA（GeneBank登录号： NC_028422.1）为内参基因，内参基因引物为QBs28sRNA-F和QBs28sRNA-R。利用Hsp17.3-F和Hsp17.3-R对不同的样品进行半定量RT-PCR扩增，分析该基因在不同组织中的表达情况。

1.2.6 BsHsp17.3基因在不同胁迫条件下的表达情况分析 实时荧光定量PCR采用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（TaKaRa），相对定量使用参照基因的ΔCT，ΔCT=CT目标基因-CT28s。根据克隆到的BsHsp17.3基因序列设计荧光定量检测引物QBsHsp17.3F和QBsHsp17.3R（表1），以白及28sRNA为内参基因，内参基因引物为QBs28sRNA-F和QBs28sRNA-R。qRT-PCR扩增体系、扩增程序参照试剂盒说明书进行。将生长良好的白及幼苗分别置于0 ℃、35 ℃，20%PEG模拟干旱胁迫处理0、0.5、2、8、12 h。分别提取上述叶片的总RNA，采用实时荧光定量PCR技术检测BsHsp17.3基因在不同胁迫处理下的相对表达量，每份样品3次重复，数据通过2-ΔΔCT 方法分析。数据统计分析采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 20.0软件。

2 结果与分析

2.1 BsHsp17.3基因的克隆与序列分析

采用RACE技术，从白及叶片中得到一条约500 bp的扩增产物（图1），将克隆得到的目的条带进行测序。测序结果显示目的基因长度为527 bp，通过分析显示该基因的开放阅读框为453 bp，可编码150个氨基酸，将其命名为BsHsp17.3。为了解BsHsp17.3蛋白的生物学活性及潜在功能，利用在线软件SWISS-MODEL对BsHSP17.3蛋白的理化性质和结构域进行分析和预测，结果显示BsHsp17.3蛋白的分子量为17.42 kD，等电点为6.33。该蛋白含有热休克ACD核心区域，一段是Pro-X（14）-Gly-Val-Leu，另一段是Pro-X（13）-Val/Leu序列，中间被亲水的片段隔开（图2）。将获得的BsHsp17.3翻译成氨基酸序列进行Blast搜索，结果发现该蛋白与铁皮石斛（Dendrobium catenatum）HSP17.3（登录号为XP_020678819.1）蛋白具有54%的相似性；与亚洲棉（Gossypium arboreum）HSP17.3（登录号为XP_017639609） 蛋白具有49%的相似性；与蓖麻（Ricinus communis）HSP17.3 （登录号为XP_002520483）蛋白具有48%的相似性（图3）。

2.2 HSP17.3的分子系统发育分析

为了进一步研究HSP17.3的进化关系，将BsHSP17.3氨基酸序列与其他18种植物的HSP17.3氨基酸构建系统进化树（图4）。图4结果表明：同为兰科的铁皮石斛、蝴蝶兰与白及进化关系较近，同源性较高。不同科植物中的HSP17.3氨基酸进化较保守，如大戟科的蓖麻和麻疯树在同一分支上，豆科的大豆、树豆和蔓花生在同一分支上，茄科的辣椒、煙草和野生烟草在同一分支上，锦葵科的亚洲棉和陆地棉在同一分支上，

2.3 BsHsp17.3基因在不同组织中的表达分析

利用Trizol法分别提取白及的根、鳞茎、幼叶、花组织总RNA，并反转录成cDNA，以白及28sRNA为内参基因，通过半定量RT-PCR检测BsHsp17.3基因在不同组织中的表达情况。图5结果表明，BsHsp17.3基因在白及幼叶和根中进行表达，在鳞茎和花中不表达。

2.4 BsHsp17.3基因在逆境处理下的表达特征分析

利用实时荧光定量PCR检测BsHsp17.3基因在逆境处理下的表达特征。图6结果表明，在0 ℃低温胁迫下，处理0.5 h时，BsHsp17.3基因相对表达量快速上升达到最高，随着处理时间延长相对表达量逐渐减少，到12 h时与对照非常接近。这说明BsHsp17.3基因能快速响应低温胁迫，诱导表达上调，但随着时间推移，基因的表达会被抑制，mRNA被降解。在35 ℃高温胁迫下，BsHsp17.3基因表达情况和低温胁迫较相似。在处理0.5 h时，BsHsp17.3基因相对表达量快速上升达到最高，随后信号逐渐减弱。BsHsp17.3基因在20%PEG模拟干旱胁迫条件下相对表达量没有显著上升，且随干旱胁迫时间延长，该基因表达没有显著变化。上述研究表明BsHsp17.3基因在低温以及高温胁迫时表达量均会上调，该基因在植物防御低温及高温胁迫中发挥一定作用。

3 讨论

诱导型热激蛋白的累积决定着真核生物细胞的耐热性。在热激条件下，生物体大部分正常蛋白的合成受到抑制，热激蛋白开始合成，合成的热激蛋白可保护机体蛋白质免遭损伤或修复已受损伤的蛋白质，从而对生物体起到保护作用（Ruibal et al，2013）。小分子热休克蛋白（sHSPs）单体都比较小，大小介于15～42 kD之间，核心区域是含有100个氨基酸左右的α-晶体蛋白区域。大分子量的热休克蛋白是目前发现的最保守蛋白之一，它在亲缘关系较远的物种中也保持较高的同源性，为60%～80%（Ruibal et al，2013；Chauhan et al，2012）。但是，小分子热休克蛋白的保守性较低。在拟南芥中发现，sHSPs家族（sHSP17、sHSP20、sHSP22）的同源性低于50%（阮文进等，2016；Murakami et al，2004）。同种类型的sHSP在不同物种中的同源性也较低，水稻中的sHSP21与拟南芥、烟草和大豆中的sHSP21同源性都低于52%（Gustavsson et al，2002；Kaur et al，2015）。本研究也证实了这一结论，BsHsp17.3与铁皮石斛HSP17.3蛋白具有较高的同源性，才达到54%的相似性，与亚洲棉、蓖麻中的HSP17.3蛋白同源性都低于50%。小分子热激蛋白家族C端α-晶体蛋白称为热休克ACD区域，这一区域具有较高的保守性（杨贵燕等，2015；Sun et al，2012；Ruibal et al，2013）。ACD区域含有两端序列，分别为Pro-X（14）-Gly-Val-Leu和Pro-X（14）-X-Val/Leu，两端序列被亲水氨基酸片段隔开，白及Hsp17.3蛋白结构也证实了这一观点（孙爱清等，2015；Ruibal et al，2013）。

sHSP作为植物热激蛋白家族的重要一员，对于维持细胞内蛋白的正确构象，避免蛋白的聚集有重要作用。与大多数热激蛋白基因类似，sHSPs不仅能响应热刺激，而且能响应低温、重金属、紫外辐射和高盐胁迫等（Sun et al，2001；Zou et al，2012；孙爱清等，2015）。将35S CaMV 启动子驱动的番茄叶绿体小分子热激蛋白cDNA 导入番茄表明，叶绿体小分子热激蛋白的过量表达提高了植物抗寒性（Wang et al，2005）。过量表达叶绿体HSP21 基因也能增强拟南芥的强光和高温胁迫抗性（Zhang et al，2013，2014；Siddique et al，2008）。还有研究表明，小分子热激蛋白与植物细胞的减数分裂有关（苏晴等，2013）。转OsHSP18.2基因的拟南芥种子能够通过减少ROS积累的毒害从而提高种子活力和寿命（Zhao et al，2014；朱丽伟等，2016）。在核桃中瞬时过表达JrsHsp17.3能显著提高株系的SOD、POD等酶的活性，从而抵抗低温、高温和高盐胁迫（杨贵燕等，2015）。从白及中分离的BsHsp17.3基因与其他小分子热激蛋白表达特性是一致的，能够快速响应高温胁迫，其诱导表达水平受到胁迫温度和时间的影响。胁迫温度越低或越高，基因表达响应越快，并且基因的表达不会随胁迫时间的延长而积累。在PEG模拟干旱胁迫下，BsHsp17.3基因表达没有显著变化，可能是因为白及鳞茎中积累了大量的多糖，提高了细胞内的渗透压，阻止了细胞内水分的丧失，这也是BsHsp17.3基因在鳞茎中不表达的原因。

白及具有重要的药用价值。在高温和低温情况下，白及地上部分植株枯萎进行倒苗，这大大缩短了白及的生长周期，减缓了白及鳞茎的生长。对白及BsHsp17.3基因表达分析的研究有助于人工栽培白及温度条件的控制，缩短倒苗的时间，起到增产增收的经济效益。植物抗逆是一个复杂的综合反应机制，小分子热激蛋白参与了非生物胁迫的过程，在细胞内通过何种信号转导途径引起BsHsp17.3基因的表达，还有待进一步的研究。

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