牛樟芝中一个新型还原型聚酮合酶基因的克隆及表达分析

原晓龙 华梅 陈剑 王娟 杨宇明 王毅

摘 要： 为了研究牛樟芝中PKS基因与化合物之间的关系，该研究通过对牛樟芝基因组分析获得牛樟芝聚酮合酶基因，以此序列为模板设计含有起始密码子和终止密码子的特异引物并以牛樟芝cDNA为模板克隆获得一个高度还原型PKS（HR-PKS）基因全长，命名为AcPKS2；对AcPKS2基因进行生物信息学分析，并比较该基因在不同培养基上的表达量。结果表明：AcPKS2全长7 842 bp，有24个内含子，其外显子共编码2 613个氨基酸，该蛋白的相对分子质量为293.5 kDa ，理论等电点pI为5.78。用CDD分析其结构域显示，该基因属于HR-PKS，其结构域组织排列为KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP-TE，8个结构域其活性位点分别为β-酮基合成酶（DTACSSSL）、酰基转移酶（GHSIGETA）、脱水酶（RNDGSTSPL）、甲基转移酶（SFDIITAFDV）、烯酰还原酶（HAGVSSPAA）、酮基还原酶（GSPGQANYTAA）、酰基转移酶（YGLDSLTSVRL）、硫酯酶（KQPNGPY）。系统发育树显示AcPKS2与其他化合物未知的HR-PKS蛋白聚为一支，结构域和系统进化树分析显示该基因可能编码一种新的含TE结构域高度还原型聚酮合酶；表达分析结果显示葡萄糖和果糖能够诱导该基因的表达。

关键词： 牛樟芝， 高度还原型PKS， 生物信息学分析， 基因表达

中图分类号： Q939.92 文献标识码： A 文章编号： 1000-3142（2018）09-1146-09

Abstract： We isolated the polyketide synthase gene with anlyzing the genome of Antrodia camphorata， designed special primers including initial coden and stop coden according to the DNA sequence of this gene. Then， we cloned the full length of a PKS gene using the cDNA of A. camphorata， it is a part of HR-PKS and named as AcPKS2. We used bioinformatic methods to analyze AcPKS2 gene and its proteinic sequence， and compared the expression level of AcPKS2 gene culturing in different media. The results showed that the gene AcPKS2 had 7 842 bp including 24 introns， all the exons encoded 2 613 amino acids； and its relative molecular weight was 293.5 kDa， the theoretical isoelectric point（pI） was 5.78. The result of conserved domain database （CDD） analysis revealed that the organization domain of AcPKS2 was KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP-TE， the active sites of eight domains were β-ketosynthase（DTACSSSL）， acyltransferase（GHSIGETA）， dehydratase（RNDGSTSPL）， methyl-transferase（SFDIITAFDV）， enoyl reductase（HAGVSSPAA）， ketoreductase（GSPGQANYTAA）， acyl carier protein（YGLDSLTSVRL）， thioesterase （KQPNGPY）， respectively. Phylogenetic analysis clarified that AcPKS2 and another HR-PKS that their products had not identified clustered together， the domain and phylogenetic tree analysis could anthenticated that AcPKS2 gene encoded a new HR-PKS that includes TE domain. The gene expression analysis showed glucose and fructose could improve the ability of AcPKS2 gene expression.

Key words： Antrodia camphorata， highly reducing polyketide synthase， bioinformatics， gene expression

聚酮化合物（polyketides， PK）是一類最重要的次生代谢产物，现已明晰的结构已超过7 000种，市场上聚酮类药物已超20种（Cox， 2007； Hertweck， 2009）。聚酮化合物的合成依赖于聚酮合酶（polyketides synthase， PKS），其催化过程类似于脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FAS）合成脂肪酸，即通过脂酰基-CoA活化底物，并在不同的底物之间不断重复脱羧缩合形成数量庞大、结构丰富的次生代谢产物（Seshime et al， 2005； Shen， 2003），从结构相对简单的芳香类（如苔色酸、6-methylsalicylic acid等）到结构复杂的高度还原型聚酮类（如T-毒素、洛伐他汀等）（Hideki et al， 2010）。真菌PKS主要属于Ⅰ型聚酮合酶，根据其所拥有结构域的不同可将真菌Ⅰ型PKS分为非还原型PKS（Non-reducing PKS）、部分还原型PKS（Partial-reducing PKS）、高度还原型PKS（Highly-reducing PKS）（Kroken et al， 2003； Sato et al， 2017）。像洛伐他汀（Lovastatin）（Ma et al， 2009）、细胞松弛素（Cytochalasans）（Scherlach et al， 2010）等源自真菌的聚酮类化合物的碳骨架主要由高度还原型PKS催化合成的（Liu et al， 2017）。

高度还原型PKS是由功能相对独立的且可重复使用的不同酶结构域组成的巨型合酶（Khosla et al， 2007），不同的结构域组合方式可产生不同的还原型聚酮类化合物（Halo et al， 2008）。如源自土曲霉（Aspergillus terreus）具降胆固醇活性的药物洛伐他汀（Ma et al， 2009）；对哺乳动物鲨烯合酶具潜在抑制效应、可有效治疗朊病毒感染的神经元的聚酮类化合物萨拉哥酸A（Zaragozic acid A）[又名角鲨抑素S1（Squalestatin S1）] （Bonsch et al， 2016； Liu et al， 2017）；均属高度还原型聚酮类化合物。HR-PKS除具有β-酮基合成酶（KS）、酰基转移酶（AT）、酰基载体蛋白（ACP）这三个PKS最基本的结构域外，还具有与β-酮加工合成相关的酮基还原酶（KR）、脱水酶（DH）和烯酰还原酶（ER），将新合成的β-酮基还原成为β-醇、脱水成为α-β不饱和烯酰基、还原双键成为亚甲基等（Cox， 2007； Hertweck， 2009； Kroken et al， 2003； Sato et al， 2017）。Cox & Simpson（2009）根据产物结构和催化方式的不同，将HR-PKS分成两类：一类为合成大环内酯类如洛伐他汀；另一类为与NRPS结合形成肽酯类如镰菌素等。聚酮合酶与化合物之间相关关系的研究已有初步进展，Cox et al（2004）通过MT（甲基转移酶）单元保守序列设计特异引物克隆得到与他汀类药物角鲨抑素类生物合成相关的PKS基因。为了研究牛樟芝中PKS基因与化合物之间的关系，本研究在对其基因组数据分析的基础上，分离并克隆得到牛樟芝中的聚酮合酶基因（AcPKS2）全长cDNA，采用生物信息学的方法对AcPKS2基因进行分析，测定AcPKS2基因在添加了不同碳氮源的培养基上的表达量，以期为进一步研究牛樟芝聚酮合酶基因的异源表达、AcPKS2基因和具体化合物的联系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

牛樟芝菌株由从台湾地区购买的段木上的牛樟芝子实体分离获得，经形态及ITS鉴定为牛樟芝，菌种编号为LKYAC01。在25 ℃恒温培养箱中用麦芽糖酵母提取物培养基（malt yeast extract，美国BD）进行扩繁培养。

1.2 方法

1.2.1 牛樟芝AcPKS2基因全长的克隆 收集于25 ℃恒温条件下培养30 d的牛樟芝菌丝体，用植物RNA提取试剂盒（康为世纪）提取牛樟芝菌丝体总RNA，使用NanoDropTM 2000紫外分光光度计（美国 Thermo Fisher）测定RNA的浓度和质量，并将RNA反转录成cDNA，保存于-80 ℃冰箱。

通过对已测序的牛樟芝基因组数据搜索获得一个与聚酮化合物生物合成相关的基因AcPKS2的全长cDNA序列，利用在线程序GENE Fisher分别设计含有起始密码子（AcPKSF0）和终止密码子（AcPKSR0）的一对特异引物（表1）进行cDNA克隆。以AcPKSF0和AcPKSR0为引物，利用高保真聚合酶（HiFi-DNA polymerase）进行PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后，将目的片段与克隆载体连接，筛选得到阳性克隆并进行测序。

1.2.2 AcPKS2基因及蛋白质生物信息学分析 利用NCBI上的在线程序ORF Finder对AcPKS2基因进行开放閱读框预测，BLAST程序进行序列同源性比较，ProtParam进行蛋白质理化性质（等电点、分子量）分析，用SignalP 4.1 server预测信号肽的有无，用Target P预测其亚细胞定位，用NCBI中的Conversed Domain Database数据库搜索AcPKS2蛋白的结构功能域。选取与牛樟芝AcPKS蛋白质序列同源性较高的其他真菌的PKS蛋白序列一起，用MEGA 6.0软件进行氨基酸序列同源性分析及系统发育分析，进行Clustal W程序比对后，采用Neighbor-Joinging 程序构建进化树，1 000次重复，其他参数选用默认值。生物信息学所用在线工具及其网址见表2。

1.2.3 牛樟芝AcPKS2基因在不同培养基上的表达分析 项目组之前的研究表明，不同碳氮源及配方的培养基对牛樟芝生长速度有显著影响（赵能等，2016）。在前期研究结果的基础上，先选取适合牛樟芝菌丝体快速生长的1-11号培养基应用于AcPKS2基因表达实验，具体配方见表3；再用商业培养基MEB（麦芽浸粉13 g·L-1）、PDA（马铃薯浸粉 5 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1）、WB（麦芽浸粉 15 g·L-1， 麦芽糖12.75 g·L-1）、SA（葡萄糖 20 g·L-1）和TMG（番茄浸粉10 g·L-1， 麦芽糖5 g·L-1， 葡萄糖10 g·L-1）验证其AcPKS2基因的表达情况。按照所选的培养基配方配置，并接种牛樟芝菌丝体，置于25 ℃恒温培养箱中培养40 d后，从每种培养基上各获取0.5 g牛樟芝真菌菌丝体，重复3次取样，并依据真菌RNA提取试剂盒（康为世纪）的说明提取总RNA。牛樟芝总RNA参照反转录试剂盒（Transgen）说明书合成第一条链cDNA，并于-20 ℃冰箱保存备用。然后，以特异引物TacPKS1F、TacPKS1R（表1）检测生长于不同培养基上的牛樟芝AcPKS2基因具体表达情况，进行琼脂糖凝胶电泳检测后，利用图像分析软件GENE-SNAPS分析其积分光密度，并进行相对定量表达分析。

2 结果与分析

2.1 牛樟芝AcPKS2基因全长的获得

以牛樟芝真菌菌丝体总RNA反转录的cDNA为模板，以AcPKSF0和AcPKSR0为引物，利用高保真聚合酶（HiFi-DNA polymerase）进行PCR扩增的方法获得一条长度约为7.5 kb的片段，琼脂糖凝胶电泳检测后回收、克隆并测序后获得7 842 bp的cDNA序列。BLASTP比对分析显示该基因的cDNA与密褐褶孔菌（Gloeophyllum trabeum，XM_007871656.1）、根状索孔菌（Fibroporia radiculosa，XM_012328483.1）、荚果腐病菌（Moniliophthora roreri，XM_007857385.1）等真菌的聚酮合酶DNA序列分别具有70%、72%和73%的一致性，并将该基因命名为AcPKS2。通过比对AcPKS2 cDNA和DNA序列，显示该基因有24个内含子，其外显子共编码2 613个氨基酸。

2.2 AcPKS2蛋白序列的生物信息学分析

用在线软件ProtParam预测AcPKS2蛋白质序列的理化性质，相对分子质量为293.5 kDa，理论等电点pI为5.78 ，结构式为C13133H20526N3534O3895S101，不稳定系数为39.66，为稳定蛋白，脂肪系数91.54，平均亲水性值为0.013，亲水性较弱；SignalP 4.1 server分析结果显示，该蛋白不存在信号肽，为非分泌蛋白；采用Target P在线软件预测其亚细胞定位，存在线粒体的可能性为0.216、分泌途径为0.050，其他位置为0.788，可靠性为3，结合SignalP 4.1 server分析结果，推测该蛋白位于细胞质基质的可能性最大。用CDD预测该蛋白序列的结构域，结果显示该蛋白含有KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP-TE等结构域 （图1）。将牛樟芝AcPKS2与其他高度还原型聚酮合酶对应的结构域进行比对发现AcPKS2的8个结构域其活性位点分别为β-酮基合成酶（DTACSSSL）、酰基转移酶（GHSIGETA）、脱水酶（RNDGSTSPL）、甲基转移酶（SFDIITAFDV）、烯酰还原酶（HAGVSSPAA）、酮基还原酶（GSPGQANYTAA）、酰基转移酶（YGLDSLTSVRL）、硫酯酶（KQPNGPY）（图2）。

2.3 AcPKS2蛋白的分子系统进化分析

利用MEGA 6.0中的Clustal W程序对AcPKS2蛋白序列和其他真菌的31条Ⅰ型PKS的蛋白序列进行多序列比对后，用邻位相接法构建分子系统进化树，1 000次重复，其他参数选用默认值。分析结果显示（图3）：以非还原型PKS作为外接参照组，高度还原型PKS可分为5组，牛樟芝AcPKS2蛋白序列与密褐褶孔菌（Gloeophyllum trabeum， XP_007869847.1 ）、毛韧革菌（Stereum hirsutum， XP_007309121.1 ）和孢荚腐病菌（Moniliophthora roreri， XP_007849738.1 ）聚为一支，合成产物目前不明确。另外Clade Ⅰ分为ⅠA、ⅠB两个亚组，ⅠA组的结构域KS-AT-DH-ER-KR-ACP-（ACP），合成T-toxin 母核；ⅠB组结构域为KS-AT-DH-MT-ER-KR-ACP，合成单环类毒素母核（如2-吡咯烷酮）。CladeⅡ组的结构域为KS-AT-DH-MT-SDR-ER-KR-（AMP-ACP），生成洛伐他汀類母核。CladeⅢ的结构域为KS-AT-DH-MT-（SDR）-ER-KR-ACP，合成大环内酯类聚酮化合物。Clade Ⅳ的结构域为KS-AT-DH-（MT）-ER-KR-ACP，合成伏马菌素类母核。与牛樟芝AcPKS2蛋白序列所在的第Ⅴ组进行比较，仅该组存在结构域TE，可推测其合成产物为一种新的聚酮类化合物。

2.4 不同碳氮源添加物对牛樟芝AcPKS2基因表达的影响

根据项目组之前的研究，牛樟芝菌丝体在不同的培养基上生长速度差异较大（赵能等， 2016）。将牛樟芝菌丝体培育在17种不同的培养基上，25 ℃恒温培养箱中培养40 d后，提取RNA反转录成cDNA，并用特异引物（表1）检测其表达情况。结果显示（图4：A）：在不同碳源添加物的分析试验中，果糖（fru）和葡萄糖（glu）能够诱导AcPKS2基因的表达，而在基本培养基（none）、添加甘露糖（man）和乳糖（lac）的培养基上不表达，其中添加了葡萄糖的培养基上该基因的表达量最高；在不同氮源添加物的分析试验中（图4：B），以麦芽糖和葡萄糖作为碳源的前提条件下，不同氮源均可诱导该基因表达，但其表达量存在显著差异，其诱导表达量从高到低依次为 酵母提取物（MFY2）、土豆蛋白胨（MFS）、牛肉浸粉（MFB）、酪蛋白胨（MFL）、胰蛋白胨（MFY1）、番茄浸粉（MFT）；其中诱导表达量最高的培养基MFY2与最低的MFT之间相差5倍之多。同时采用不同的商业培养基测试该基因的表达情况，结果显示（图4：C）：TMG诱导表达量最高，从高到低依次为YMB、WB、PDA、MEB、SA。

3 讨论

牛樟芝（Antrodia camphorata）属于多孔菌科（Polyporaceae）薄孔菌属（Antrodia）真菌，是我国台湾地区所特有的珍贵食药两用真菌（Lu et al， 2014； Wu et al， 2004）。牛樟芝中含有丰富的具生理活性的次生代谢产物，如牛樟芝子实体中特有的聚酮化合物安卓凯因A （antrocamphin A）（Hsieh et al， 2010； Lee et al， 2011）。依据牛樟芝基因组测序结果，研究者发现牛樟芝基因组中存在14个可能为PKS的基因片段，其中有4个PKS基因编码的氨基酸数量超过了2 000个（Lu et al， 2014），本项目组通过对牛樟芝基因组的分析，获得1条高度还原型PKS基因AcPKS2基因。尚未有关于聚酮合酶基因与化合物之间联系的报道，本研究的目的是从牛樟芝基因组中分离聚酮合酶基因，并研究其在不同培养条件下的表达状况，最终目的为确定基因与化合物之间的联系。

本研究通过对AcPKS2基因和其蛋白序列进行生物信息学分析，通过结构域分析获知AcPKS2蛋白含有HR-PKS特有结构域β-酮基还原酶（KR）和烯酰还原酶（ER），可推断该基因属于HR-PKS；结构域分析显示AcPKS2蛋白中含有硫酯酶释放结构域（TE）。TE结构域通常位于C-末端，许多真菌的非还原型聚酮合酶的TE结构域负责催化环化反应形成大环内酯（Du & Lou， 2010）并释放聚酮化合物，但目前尚未有TE结构域存在于HR-PKS中的报道。在非还原型聚酮合酶中，与TE结构域功能类似的结构域还有C-末端还原酶释放结构域（R）（Kroken et al， 2003）、C-末端酯酶/类脂肪酶（EST）结构域（Ishiuchi et al， 2012），类金属-β-内酰胺酶（MβL）水解酶（Scherlach et al， 2010）等。这些酶结构域的功能已通过试验得到证明，如Fujii et al（2001）通过异源过量表达wA-PKS基因修饰过的C-末端首次证明TE结构域参与克莱森环化反应，该结构域又被命名为克莱森式环化酶结构域（CLC），参与构巢曲霉（Aspergillus nidulans）中WA聚酮合酶催化萘并吡喃酮（naphthopyrone）第二个芳香环的克莱森式环化；R结构域催化还原释放的作用通过异源表达得到确认（Bailey et al， 2007）；EST结构域略大于TE/CLC结构域，属丝氨酸水解酶家族（Ishiuchi et al， 2012）；通过基因敲除的方式证明MβL结构域参与构巢曲霉中AptA（asperthecin PKS）聚酮产物的释放（Szewczyk et al， 2008）。AcPKS2 TE结构域的蛋白序列与密褐褶孔菌（XP_007869847.1）（Floudas et al， 2012）TE结构域的同源性为56.49%，且其保守活性位点均为KQPXGPY。聚类分析可将功能相似的基因或蛋白聚为一支，本研究中AcPKS2蛋白与其他3种功能和化合物未知的PKS蛋白聚为一支，可推断AcPKS2基因是一种含TE结构域的新型HR-PKS。

不同培養基和培养方式对牛樟芝生长速度和其活性组分均有显著的影响（赵能等， 2016；周璇等， 2017），同时同一基因在不同培养条件下，其基因表达会出现差异，且可能产生不同的化合物，这一现象可通过“一菌多产物”（one strain many compounds， OSMAC）来解释。Hemphill et al（2017）利用“一菌多产物”策略成功地从内生真菌三线镰刀菌 （Fusarium tricinctum）中获得5种化合物， 2种新化合物fusarilelin K和fusarilelin L及2种已知化合物fusarilelin A和fusarilelin B，并将化合物fusarilelin J的量增加了80倍。本研究应用含不同碳氮源添加物和商业培养基诱导AcPKS2基因的表达，不同碳源添加物试验表明葡萄糖和果糖能诱导AcPKS2基因的表达，不同氮源添加物的试验表明在碳源一致的前提条件下，酵母提取物的表达量最高，番茄浸粉表达量最低；不同商业培养基测试显示TMG表达量最高、SA最低。该结果说明牛樟芝AcPKS2基因在不同培养条件下，其表达水平具较大的差异，能够为下一步通过大规模发酵的方式获取牛樟芝聚酮化合物提供最佳培养基。本研究结果有助于牛樟芝聚酮类化合物的异源表达，为提高牛樟芝聚酮化合物的合成效率及基因调控分析奠定基础。

参考文献：

BAILEY AM， COX RJ， HARLEY K， et al， 2007. Characterisation of 3-methylorcinaldehyde synthase （MOS） in Acremonium strictum： first observation of a reductive release mechanism during polyketide biosynthesis [J]. Chem Comm， （39）：4053-4055.

BONSCH B， BELT V， BARTEL C， et al， 2016. Identification of genes encoding squalestatin S1 biosynthesis and in vitro production of new squalestatin analogues [J]. Chem Comm， 52（41）： 6777-6780.

COX RJ， 2007. Polyketides， proteins and genes in fungi： programmed nano-machines begin to reveal their secrets [J]. Org Biomol Chem， 5（13）：2010-2026.

COX RJ， GLOD F， HURLEY D， et al， 2004. Rapid cloning and expression of a fungal polyketide synthase gene involved in squalestatin biosynthesis [J]. Chem Comm， 10（20）：2260-2261.

COX RJ， SIMPSON TJ， 2009. Fungal type I polyketide synthases [J]. Meth Enzymol， 459：49-78.

DU L， LOU L， 2010. PKS and NRPS release mechanisms [J]. Nat Prod Rep， 27（2）： 255-278.

FLOUDAS D， BINDER M， RILEY R， et al， 2012. The paleozoic origin of enzymatic lignin decomposition reconstructed from 31 fungal genomes [J]. Science， 336（6089）：1715-1719.

FUJII I， WATANABE A， SANKAWA U， et al， 2001. Identification of Claisen cyclase domain in fungal polyketide synthase WA， a naphthopyrone synthase of Aspergillus nidulans [J]. Chem Biol， 8（2）：189-197.

HALO LM， MARSHALL JW， YAKASAI AA， et al， 2008. Authentic heterologous expression of the tenellin iterative polyketide synthase nonribosomal peptide synthetase requires coexpression with an enoyl reductase [J]. Chembiochem， 9（4）： 585-594.

HEMPHILL CF， SUREECHATCHAIYAN P， KASSACK MU， et al， 2017. OSMAC approach leads to new fusarielin metabolites from Fusarium tricinctum [J]. J Antibiot， 70（6）：726-732.

HERTWECK C， 2009. The biosynthetic logic of polyketide diversity [J]. Angew Chem Int Ed， 48（26）：4688-4716.

HIDEKI S， NAOYUKI I， TSUYOSHI S， 2010. Functional analysis of fungal polyketide biosynthesis genes [J]. J Antibiot， 63（5）：207-218.

HSIEH YH， CHU FH， WANG YS， et al， 2010. Antrocamphin A， an anti-inflammatory principal from the fruiting body of Taiwanofungus camphoratus， and its mechanisms [J]. J Agric Food Chem， 58（5）： 3153-3158.

ISHIUCHI K， NAKAZAWA T， OOKUMA T， et al， 2012. Establishing a new methodology for genome mining and biosynthesis of polyketides and peptides through yeast molecular genetics [J]. Chembiochem， 13（6）： 846-854.

KHOSLA C， TANG Y， CHEN AY， et al， 2007. Structure and mechanism of the 6-deoxyerythronolide B synthase [J]. Ann Rev Biochem， 76（1）：195-221.

KROKEN S， GLASS NL， TAYLOR JW， et al， 2003. Phylo-genomic analysis of type I polyketide synthase genes in pathogenic and saprobic ascomycetes [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 100（26）：15670-15675.

LEE CL， HUANG CH， WANG HC， et al， 2011. First total synthesis of antrocamphin A and its analogs as anti-inflammatory and anti-platelet aggregation agents [J]. Org Biomol Chem， 9（1）：70-73.

LIU N， HUNG YS， GAO SS， et al， 2017. Identification and heterologous production of a benzoyl-primed tricarboxylic acid polyketide intermediate from the zaragozic acid A biosynthetic pathway [J]. Org Lett， 19（13）：3560-3563.

LU MY， FAN WL， WANG WF， et al， 2014. Genomic and transcriptomic analyses of the medicinal fungus Antrodia cinnamomea for its metabolite biosynthesis and sexual development [J]. Proc Nat Acad Sci USA， 111（44）：E4743-4752.

MA SM， LI JW， CHOI JW， et al， 2009. Complete reconstitution of a highly reducing iterative polyketide synthase [J]. Science， 326（5952）：589-592.

SATO M， DANDER JE， SATO C， et al， 2017. Collaborative biosynthesis of maleimide- and succinimide-containing natural products by fungal polyketide megasynthases [J]. J Am Chem Soc， 139（15）：5317-5320.

SCHERLACH K， BOETTGER D， REMME N， et al， 2010. The chemistry and biology of cytochalasans [J]. Nat Prod Rep， 27（6）：869-886.

SESHIME Y， JUVVADI PR， FUJII I， et al， 2005. Discovery of a novel superfamily of type Ⅲ polyketide synthases in Aspergillus oryzae [J]. Biochem Biophys Res Comm， 331（1）：253-260.

SHEN B， 2003. Polyketide biosynthesis beyond the type I， Ⅱ and Ⅲ polyketide synthase paradigms [J]. Curr Opin Chem Biol， 7（2）： 285-295.

SZEWCZYK E， CHIANG YM， OAKLEY CE， et al， 2008. Identification and characterization of the asperthecin gene cluster of Aspergillus nidulans [J]. Appl Environ Microbiol， 74（24）：7607-7612.

WU SH， YU ZH， DAI YC， et al， 2004. Taiwanofungus， a polypore new genus [J]. Fungal Sci， 19（3-4）：109-116.

ZHAO N， YUAN XL， CHEN J， et al， 2016. Effect of different carbon and nitrogen sources on mycelia growth of Antrodia cinnamomea [J]. J W Chin For Sci， 45（4）：7-12. [赵能， 原晓龙， 陈剑， 等， 2016. 不同碳氮源对牛樟芝菌丝体生长的影响 [J]. 西部林业科学， 45（4）：7-12.]

ZHOU X， XIA YJ， LIU SN， et al， 2017. Influences of cultivation methods on active components of Antrodia camphorata [J]. Ind Microbiol， 47（2）：18-23. [周璇， 夏永軍， 刘胜男， 等， 2017. 不同培养方式对牛樟芝活性组分的影响 [J]. 工业微生物， 47（2）：18-23.]