植物凝胶和蔗糖对橡胶树体胚植株再生的影响

顾晓川 徐正伟 成镜 何兴辉 华玉伟

摘 要： 为了筛选巴西橡胶体胚植株最为适合的植物凝胶和蔗糖用量，该研究以巴西橡胶树无性系热研7-33-97成熟体细胞双子叶次生胚状体为材料，以添加0.23 μmol·L-1 KT，0.11 μmol·L-1 IAA和8.7 μmol·L-1 GA3的MS培養基为植株再生培养基，研究了添加不同用量的植物凝胶和蔗糖对巴西橡胶树体胚植株再生和生长的影响。结果表明：在橡胶树体细胞胚植株再生培养基中，不同用量的植物凝胶对植株再生频率和植株生长状况有显著影响，较低浓度（0～1 g·L-1）时，随着用量增加，植株再生频率提高，但较高浓度（1～4 g·L-1）时，随着用量增加，植株生长受到抑制。植物凝胶添加1 g·L-1时植株生长最好，植株再生率为（86.4±5.7）%，株高5 cm以上的占（53±9.4）%，带叶植株为（81.7±3）%；而蔗糖对植株再生频率影响不显著，但对再生植株生长的影响显著，低蔗糖（20～30 g·L-1）时促进植株抽叶但抑制茎干伸长，高蔗糖（70～80 g·L-1）时显著抑制抽叶但促进茎干伸长。蔗糖添加50 g·L-1时植株生长最好，株高5 cm以上的占（57.6±5.4）%，株高5 cm以上带叶植株占（46.3±12.3）%，均为最高且从外观来看，在50 g·L-1时植株茎干和根都较为粗壮。因此，在橡胶树体细胞胚植株再生培养基中，植物凝胶和蔗糖最佳用量分别为1 g·L-1和50 g·L-1。

关键词： 植物凝胶， 蔗糖， 胚状体， 橡胶树， 植株再生

中图分类号： Q945 文献标识码： A 文章编号： 1000-3142（2018）09-1164-08

Abstract： Phytagel and sucrose have great influence on the regeneration efficiency of somatic embryos and growth of regenerated plants. In this study， effects of phytagel and sucrose on the regeneration of somatic embryos and growth of regenerated plants were carried out on mature cotyledonary embryos from Hevea brasiliensis clone Reyan7-33-97. MS me-dium supplemented with 0.23 μmol·L-1 KT， 0.11 μmol·L-1 IAA and 8.7 μmol·L-1 GA3 was used as the plant regeneration medium. The results showed that appropriate phytagel was helpful for the regeneration efficiency of somatic embryos and growth of regenerated plants. At lower concentrations （0-1 g·L-1）， the frequency of plant regeneration increased with the increase of the amount of phytagel， but at higher concentrations （1-4 g·L-1）， plant growth was inhibited along with the increasing amounts of phytagel. When the phytagel was supplemented in somatic embryo regeneration medium with 1 g·L-1， the plant regeneration rate， the plants （height >5 cm） and the plants with leaves reached （86.4 ± 5.7）%， （53 ± 9.4）% and （81.7 ± 3）%， respectively， higher than other treatments； For sucrose， no effect on the regeneration efficiency of somatic embryos was observed when sucrose was supplemented in somatic embryo regeneration medium， however， significant effects on growth of regenerated plant were observed. When the sucrose was supplemented in somatic embryo regeneration medium with 50 g·L-1， the plants （height >5 cm） and the plants with leaves （height >5 cm） reached （57.6±5.4）% and （46.3±12.3）%， respectively， higher than other treatments， and the stems and roots were very strong from the outside. Moreover， lower sucrose （20-30 g·L-1） promoted the growth of leaves as plant sprouting， but the elongation of stem was supressed， in contrast， higher sucrose （70-80 g·L-1） suppressed the growth of leaves but promoted the elongation of the stem. Overall， the somatic embryo regenaration medium supplimented with 1 g·L-1 phytagel and 50 g·L-1 sucrose was the most approciate for somatic embryo regenaration in H. brasiliensis.

Key words： phytagel， sucrose， embryos， rubber tree， plant regeneration

天然橡膠是重要的战略物资和工业原料。目前天然橡胶主要来源于巴西橡胶树胶乳，不同橡胶树种植材料胶乳产量具有显著差异。橡胶树体胚苗是以高产品种花药或内珠被等为外植体，由体细胞胚直接繁育而来的新型种植材料。1980年，我国科学家王泽云首次在世界上培育出体胚苗植株（王泽云等，1980）。同时，国内外大田数据显示体胚苗是一种幼态化的种植材料，在产量、抗性、一致度等方面都优于橡胶树第一代种植材料（实生种子苗）和第二代种植材料（老态芽接苗）（王泽云等，2001；陈雄庭等，2002），是具有推广应用前景的第三代种植材料。华玉伟等（2007）和Hua et al（2010）通过体细胞胚循环增殖，实现了体细胞胚的大规模繁殖。

培养基成分、培养基渗透势、体细胞胚的状态和萌发前的物理处理等因素，均影响体细胞胚植株再生和植株生长，其中凝固剂和碳水化合物直接影响培养基的渗透势，对体胚植株再生和生长具有显著影响。较高琼脂浓度增强培养基保水能力，限制胚状体对水分的吸收，使胚状体含水量下降，从而起到提高胚再生植株频率的作用。同时，较高浓度琼脂可降低试管苗的玻璃化（袁素霞等，2010）。另外，植物凝胶种类和浓度也影响到培养基中镁、钙、锌、锰、钾离子的有效含量，进而影响体细胞胚植株再生和植株生长（Li et al，1998）。而蔗糖作为一种渗透调节剂和能量，对体胚成熟和再生具有显著影响。Becwar & Pullman（1995）认为促进体细胞胚萌发的关键是将胚转入低蔗糖无激素的萌发培养基上。同样，龙眼体胚植株再生时，高浓度的蔗糖有利于体胚成熟，低浓度蔗糖利于体胚植株再生（赖钟雄和陈振光，2002）。目前，尚未看到植物凝胶和蔗糖对橡胶树体细胞胚植株再生和植株生长影响的研究报道。为此，本研究在橡胶树体胚植株再生培养基中添加不同用量的植物凝胶和蔗糖，研究它们对植株再生和生长影响的同时，以期筛选巴西橡胶体胚植株最为适合的植物凝胶和蔗糖用量。

1 材料与方法

1.1 材料

所用材料为巴西橡胶树无性系热研7-33-97成熟体细胞双子叶次生胚状体，参照Hua et al（2010）的方法培养获得。

药品：配制改良MS培养基大量元素、微量元素、铁盐所需的药品和蔗糖，采购于广州化学试剂厂。配制改良MS培养基有机成分和植物激素所需的药品，采购于上海生物工程技术有限公司。植物凝胶采购于Sigma-Aldrich公司。容器：锥形透气试管根据专利《一种锥形透气试管》（专利号为201320062994.0）进行定制。

1.2 方法

将直径1 cm以上的成熟双子叶次生胚状体，接种到装有植株再生培养基的锥形透气试管中，28 ℃光照培养，光周期为16 h。接种45 d后统计植株再生和植株生长情况。

植株再生培养基为添加0.23 μmol·L-1 KT，0.11 μmol·L-1 IAA和8.7 μmol·L-1 GA3的MS培养基。植物凝胶添加量分别为0～4 g·L-1；蔗糖添加量分别为0～80 g·L-1。每个实验3次重复，每重复接种21管，每管接种1个胚状体。

1.3 数据统计分析

植株再生频率和生长情况，通过植株再生指标（抽芽率、生根率和抽芽生根率）和再生植株生长指标（5 cm以上植株率、根长5 cm以上植株率和带叶植株率）来评价。抽芽率是指抽芽体胚数占接种总体胚数的百分率；生根率是指生根体胚数占接种总体胚数的百分率；抽芽生根率是指既抽芽又生根体胚数占接种总体胚数的百分率，5 cm以上植株率是指株高5 cm以上植株数占接种总体胚数的百分率；根长5 cm以上植株率是指根长5 cm以上植株数占接种总体胚数的百分率；带叶植株率是指再生植株中带叶的植株数占接种总体胚数的百分率；5 cm以上带叶植株率是指株高5 cm以上植株中带叶植株数占接种总体胚数的百分率。实验结果采用SPSS的Ducan法进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 植物凝胶对橡胶树胚状体植株再生和生长的影响

对于植株再生而言，培养基中添加不同用量的植物凝胶，显著影响胚状体植株再生。在添加1～4 g·L-1植物凝胶的培养基中，橡胶树胚状体的抽芽率、生根率和抽芽生根率均显著高于添加0～0.5 g·L-1植物凝胶的培养基；在添加1～4 g·L-1植物凝胶的不同培养基中，其抽芽率、生根率和抽芽生根率没有显著差异。根据同样效果最低浓度原则，橡胶树胚状体植株再生培养基植物凝胶的添加量应以1 g·L-1为宜，在该浓度下，橡胶树胚状体抽芽率86.4%、生根率97.4%、抽芽生根率86.4%，均处于较高水平，说明该浓度利于橡胶树胚状体植株的再生（表1，图1）。

对于再生植株生长而言，培养基中添加不同用量的植物凝胶，显著影响再生植株的生长。在添加1～4 g·L-1植物凝胶的培养基中，5 cm以上植株率和带叶植株率显著高于添加0～0.5 g·L-1植物凝胶的培养基，表明植物凝胶用量在1～4 g·L-1时，有利于再生植株的生长。但是，过高植物凝胶用量也影响植株生长，如植物凝胶添加量1 g·L-1时，5 cm以上植株率最高，为（53±9.4）%；当植物凝胶用量达4 g·L-1时，培养物表现为营养不良、植株矮小、叶片过早出现黄化和脱落等症状，植株生长全面受到抑制，5 cm以上植株率为0（图1：F）。综合株高5 cm以上植株率、根长5 cm以上植株率和带叶植株率三个参数，培养基中添加1 g·L-1植物凝胶，最利于橡胶树胚状体再生植株的生长。综合体胚植株再生和再生植株生长的各种指标数据，橡胶树体胚植株再生培养基中添加植物凝胶浓度1 g·L-1时，既有利于植株再生，又有利于再生植株的生长。

2.2 蔗糖对橡胶树胚状体植株再生和生长的影响

对于植株再生而言，添加蔗糖的培养基，不论是胚状体植株再生、还是再生植株生长，均明显优于无蔗糖培养基。但通过统计分析发现，在本实验中，在添加蔗糖5～80 g·L-1的不同培养基中，其胚状体的抽芽率、生根率、抽芽生根率均没有显著差别（表2），表明在本实验范围内，在含蔗糖培养基中，蔗糖添加量对橡胶树胚状体植株再生频率没有显著影响。

对于再生植株生长而言，培养基中添加不同用量的蔗糖，显著影响胚状体再生植株的生长（表2）。首先，随着蔗糖添加量的增加，5 cm以上植株率有显著性的增加，在蔗糖80 g·L-1时达到了最大值59%；其次，根长5 cm以上植株率在蔗糖10 g·L-1达到峰值，且在10～80 g·L-1范围内无明显差异；第三，带叶植株率随着蔗糖添加量的增加先升高再下降，其峰值为20～40 g·L-1。此外，在植株外观形态上，当蔗糖较低时，表现为植株矮小、根系生长和叶片发育均受显著影响，并表现出营养不良、叶片过早出现黄化、脱落等症状（图2：a，b，c）；浓度过高则表现为叶片生长发育受抑制（图2：f）。上述结果表明，蔗糖作为培养基主要的营养成分，在合适的浓度范围内可以促进橡胶树胚状体再生植株的生长，主要表现在促进株高增加、根系生长和叶片发育三个方面。

为了筛选最为适宜橡胶树胚状体再生和植株生长的蔗糖用量，本研究对20～80 g·L-1蔗糖用量进行了细化研究（表3），与上述实验结果相似， 低蔗糖时（20～30 g·L-1）促进植株抽叶但抑制茎干伸长，高蔗糖时（70～80 g·L-1）显著抑制抽叶但促进茎干伸长。从体胚植株再生和植株生长指标具体分析来看，5 cm以上植株率在50 g·L-1时达到最大值57.6%，且5 cm以上带叶植株率在50 g·L-1时也达到最大值46.3%。从外观来看，在50 g·L-1时植株茎干和根都较为粗壮（图3），故蔗糖最适用量为50 g·L-1。

3 讨论与结论

3.1 植物凝胶显著影响胚状体植株再生和再生植株的生长

在植物组织培养中，诱导植株再生需要半固相培养基支撑培养物，凝胶化的培养基可提供半固相培养基，目前有许多种凝固剂可以使培养基凝胶化。植物凝胶是一种比较好的凝固剂，具有通气性好、凝固温度低、含杂质少、不易发生玻璃化等优点，在许多植物组织培养中的培养效果都优于琼脂，然而植物凝胶的价格昂贵（张巧等，2010）。在橡胶树体胚植株再生研究中，gelrite、phytagel和agar等用于植株再生均有报道，但用量有所不同，对植株再生频率影响非常大。Hua et al（2010）在植株再生培养基中添加2.2 g·L-1 植物凝胶，其植株再生频率达85.4%。本研究对植物凝胶用量进行详细研究，发现植物凝胶添加量为1 g·L-1时，植株再生频率达到最大值（86%），较Hua et al（2010）植株再生频率略高，是目前再生频率最高的报道。同时，本研究在此用量下，5 cm以上植株率和带叶植株率显著高于2.0 g·L-1和其他处理，这说明高于最适浓度的植物凝胶在一定程度上会抑制植株再生和植株生长。再者，降低植物凝胶用量，也有助于降低种苗的生产成本。

3.2 蔗糖在胚状体植株再生和再生植株生长中的作用

碳水化合物在植物组织培养中既作为一种能源和碳源，又是一种渗透剂，被用于植物组织培养的碳水化合物包括各种糖类，经比较蔗糖是最佳碳源，葡萄糖、麦芽糖和棉子糖次之，果糖较差，甘露糖和乳糖最差（丁世萍等，1998）。蔗糖浓度对橡胶树愈伤组织和胚状体诱导的影响有过报道（王泽云等，1980；陈正华等，1978），蔗糖对胚状体植株再生和植株生长的影响尚无报道。本研究发现，蔗糖添加量并不影响胚状体再生效率，如培养基从5～80 g·L-1的抽芽率、长根率、抽芽长根率和根长5 cm以上植株率都没有显著性的差别，因此，以往报道中不同出苗率并非因為蔗糖用量引起的；然而，5 cm以上植株率和带叶植株率却有显著性的差别，表明蔗糖添加量对橡胶树胚状体植株再生的株高和抽叶影响比较大。低浓度的蔗糖添加量（10 g·L-1以下）既不利于植株增高也不利于抽叶，推断添加量太低时提供的碳水化合物不能满足橡胶树胚状体生长的需要；随着蔗糖添加量的增加植株株高显著性增高，叶片数量逐渐减少，80 g·L-1蔗糖用量时，株高达到最高，但带叶植株率达到最低。推断可能是培养基中丰富的蔗糖在一定程度上代替了叶片的光合产物，从而无需叶片的发育来提供植株生长所需能量，蔗糖用量是平衡株高和叶片发育的关键因素。为此，本研究对蔗糖用量进行了细化实验，发现橡胶树体胚植株再生培养基中蔗糖最合适用量为50 g·L-1，在此用量下5 cm以上植株率在50 g·L-1时达到最大值57.6%，且5 cm以上带叶植株率在50 g·L-1时也达到最大值46.3%，同时从外观来看，在50 g·L-1时植株茎干和根都较为粗壮。

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