钙泵的发现历程

任衍钢 白冠军 宋玉奇 路彦文

（阳泉师范高等专科学校 山西阳泉 045200）

钙泵的发现具有漫长的历史背景。早在1848年，德国生理学家雷蒙德（Emil du Bois-Reymond）在研究动物电时就假定细胞膜上存在主动运输的可能性。1948年，罗森博格（Rosenberg T.）重新阐述主动运输（Active transport）的概念［1］。1957年，丹麦科学家斯科（Skou J.C.）首先发现了第1 个具有主动运输意义的离子泵——钠钾泵。钠钾泵的发现被认为是开启了人类认识离子泵的先河，斯科也因此分享了1997年的诺贝尔化学奖［3］。钙泵则是继钠钾泵后被发现的第2 个离子泵。钙泵的研究主要在肌质网钙泵（sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase，SERCA）、动物细胞质膜钙泵（plasma membrane Ca2+ATPase，PMCA）和植物细胞钙泵3 个相对独立的领域进行，下文按照历史的进程分别介绍。

1 肌质网钙泵的发现及揭示

钙泵的发现源自于钙离子对动物肌肉收缩的影响研究。早在1885年，英国生理学家荣格（Ringer S.）发现离体青蛙心跳在蒸馏水和自来水中的表现不同（自来水中含有钙离子），他通过逐渐增加钙离子浓度的实验发现，钙是支持心脏收缩的重要因素［1］。为什么钙离子能影响肌肉的收缩？1940年，赫尔布轮（Heilbrunn L.V.）通过注射Ca2+到肌纤维中证实，钙离子是在肌纤维中起作用的［2］。20世纪40年代末，学者希尔（Hill A.V.）等在骨骼肌收缩的研究中也注意到这一点。20世纪50年代安玛莉（Annemarie W.）通过量化的方法发现在Mg2+和ATP 存在的情况下，肌肉收缩需要低浓度的Ca2+。那么，肌肉收缩时钙离子来自哪里？人们将肌纤维含有丰富的肌质网联系起来。虽然早在1902年，意大利生理学家瓦拉蒂（Veratti E.）就用光学显微镜对肌质网作了精确的描述，但并不清楚它的作用。直到20世纪50年代后，电子显微镜的应用和微量钙浓度检测生化技术的改进才为人们深入研究肌质网与钙离子的活动提供了技术条件。1962年，江桥节郞（Setsuro E.）和李普曼（Lipmann F.，1935年诺贝尔生理学奖获得者）等发现，ATP 驱动Ca2+脱离肌原纤维进入肌质网后肌肉松弛［3］。此后江桥节郞（1964）进一步发现，Ca2+从原肌球蛋白排出后肌肉才发生松弛［4］。1970—1971年，麦克伦南（Maclennan D.H.）和王（Wong P.T.S.）用脱氢胆酸盐和盐沉淀方法首次纯化了肌质网钙泵（SRCa2+Mg2+ATPase）。1985年，他们又用DNA 克隆方法获得肌质网钙泵全部氨基酸序列，并根据一级结构和X-光中子衍射图谱等提出钙泵的空间结构模型，他们的研究被认为是开辟了分析离子泵转运机制的新时期。同年，博尔曼（Berman M.C.）等通过外源荧光探针标记实验发现内质网钙泵存在2 种蛋白构象，一种为E1，对Ca2+亲和力高；另一种为E2，对Ca2+亲和力低，2 种构象α-螺旋含量不同，结合位点互相有协同作用［5］。

肌质网钙泵研究取得突破性进展是在21世纪初。2000年，丰岛（Toyoshima）等利用分辨率0.26 nm 的透镜得到肌质网膜上结合Ca2+的钙泵晶体结构。2年后他们又得到了结合Ca2+的钙泵的晶体图，随后对钙泵传导Ca2+过程中的不同钙泵晶体结构也被结晶出来。他们发现这与肌质网钙泵的拓扑性质相同［3］。2004年，丹麦科 学家索伦森（Sorensen T.L.）等也结晶出2 个不同状态的钙泵晶体结构。李（Lee A.G.）在此基础上进一步研究Ca2+的结合位点。这期间，斯托克斯（Stokes D.L.）小组提出了一个描述钙泵酶中催化循环过程的结构模型（图1）。此外，人们还发现，即使在Mg2+、Na+、K+的浓度比Ca2+的浓度高出数万倍的情况下，钙泵酶仍然会选择性吸收Ca2+。在理论方面，杉田（Sugita Y.）等运用原子-分子动力学模拟的方法确认Ca2+结合位点处酸性残基的质子化状态。卡斯特（Costa V.）等运用分子模拟和静电计算研究Ca2+结合过程中几个关键中间状态的结构和动态特征［6］。这一系列研究对进一步了解肌质网钙泵及研究心肌缺血的机制提供了新的参考依据。

图1 钙泵循环和钙离子通道示意图

2 动物细胞质膜钙泵的发现及揭示

在钠钾泵被发现之前，人们已经注意到细胞对微小的钙离子浓度变化具有很强的敏感性。但是这种差异是如何形成的，曾经是个迷，钠钾泵的发现对研究这种差异无疑是一个重要的启示。1966年，齐默曼（Zimmerman A.N.E.）等发现，用无钙的“生理盐溶液”灌注大鼠离体心脏，短时间内即发生心肌膜损伤，随后灌注正常含钙的生理溶液，心脏发生更为严重的结构和功能的改变，这种现象被称之为钙反常［7］。这种现象显然与细胞内钙离子增多（钙超载）有关。同年，沙茨曼（Schatzmann H.J.）在研究人类红血细胞时发现，ATP 酶可从细胞质中转运出钙离子，他将这种蛋白质命名为质膜钙泵（PMCA），这是人们首次将钙转运与ATP酶联系起来［8］。1977年，加里特（Jarrett H W）等首先证实有一种蛋白（钙调蛋白/钙调素，简称CaM）直接参与质膜转运钙的活性调节［9］。1979年，尼哥（Niggle V.）等利用钙调蛋白亲和层析方法将较多量的质膜钙泵纯化出来。通过纯化发现，质膜钙泵由4 种基因编码，其转录经不同类型的选择性拼接后可形成多种类型和变体。这些亚型和变体具有不同的Ca2+的外排性质，并且在不同组织和细胞中具有各异的表达水平，以满足不同类型细胞对于Ca2+精确调控的需要［10］。1980年，卡罗尼（Caroni P.）和卡洛福林（Carafolin E.）在研究动物细胞钙泵的过程中发现钙泵的主要转运特点是将Ca2+运出细胞之外［11］。1983年，科学家依据质膜钙泵大小约为251kDa，其大小接近单体人红细胞酶的2 倍推测，该离子泵以二聚体形 式存在［12］。1988年，沙尔（Shull G.E.）和格润（Greeb J.）以大鼠脑细胞为材料，针对ATP 酶结合位点，设计寡核苷酸探针，纯化得到cDNA 后推出质膜钙泵的氨基酸一级序列，发现质膜钙泵包括2 个亚型，分别含1 176 和1 198 个氨基酸［13］，他们还依据一级结构推测出钙泵的拓扑学结构。同年，维尔马（Verma A.K.）等则利用红细胞质膜钙泵的胰蛋白酶水解片段设计的寡核苷酸探针，从人畸胎瘤cDNA 文库中推导出的是含1 220 个残基的完整亚型的氨基酸序列。比较发现，该序列与大鼠中获得的第1 个亚型的前1 117 个残基有大约99%的相同［14］。1994年，费根（Fagan M.J.）和赛尔（Saier M.H.）通过用肾皮质Na+/K+-ATP 酶与质膜钙泵比较表明，这2 种泵具有类似的反应循环和35%相同的氨基酸序列，同属于P 型ATP 酶系列［15］。但是，需要指出的是，因三维晶体结构其胞质区部分较大，本身难形成构象，而蛋白质的有序排列又是解晶体结构的必要条件，且对蛋白质纯化水平也有较高的要求，所以，至今对质膜钙泵的了解仍然停留在拓扑学结构上，需要进一步攻克。

3 植物细胞钙泵的发现及揭示

植物中钙的作用过去被认为是一个难以捉摸的问题。钙在植物中的总量并不小（用mmol／L 计算），但就需求而言却属于微量营养素（micronutrient，用μmol／L 量计算），其原因在于它很大一部分存在于细胞壁处，极少的一部分存在于细胞内。植物细胞钙泵的发现主要是受动物细胞钙泵研究的影响。如早在20世纪50—60年代，科学家就在动物肝和肾细胞中发现，线粒体具有吸收和积累贮存Ca2+的能力，并且这种吸收与呼吸和ATP 活动有关，并且受解偶联剂的抑制。1965年，霍奇斯（Hodges T.K.）和汉森（Hanson J.B.）在玉米细胞中发现同类的现象［1］。但是这些发现（包括一些用放射性元素45Ca2+）虽然涉及到钙离子从细胞流出及ATP 的水解活动，但还不足以确定钙泵是来自于质膜还是细胞内的其他膜系统。直到20世纪70年代，由于科学家发现线粒体中的NADH 脱氢酶受Ca2+的调节等，植物线粒体钙泵的存在才获得了学术界的公认。故在植物细胞中的钙泵首先在线粒体上发现。20世纪80年代进一步发现，植物线粒体钙泵还受光的影响［1］，紧接着发现液泡膜上存在钙泵。1990年，布莱克福德（Blackford S.）等发现，在植物液泡中同样存在积累Ca2+的现象，1993年，菲佛（Pfeiffer W.）和海格（Hager A.）在玉米中证实液泡膜钙泵的存在［16］。

植物细胞质膜钙泵发现于20世纪80年代末至90年代初，由于技术上的改进，科学家才从萝卜苗、菠菜叶等植物组织中（通过排除其他膜系统上钙泵）证实植物细胞质膜上同样存在钙泵［17］。

植物细胞内质网钙泵于1992年在高等植物土豆和烟草中被克隆出来（它的同系物于1996 和1997年在拟南芥中发现）。1993—1994年，大卫（David E.E.）和洛林（Lorraine E.W.）发现在植物内质网中同样存在动物细胞内质网中的钙结合蛋白的同系物，且发现内质网膜上的钙泵不同于质膜上的钙泵而是与动物细胞内质网膜上的钙泵类似，植物内质网膜上的钙泵也不存在Ca/H 的逆向转运［16］。植物内质网膜上的钙泵主要参与胞浆中Ca2+的调节及在种子发芽、 分泌中起重要的作用。学者还发现，质膜钙泵与内质网钙泵的差异主要是底物的差异，大小119 kDa 的钙泵既存在于质膜也存在于内质网膜上，而大小124 kDa 的钙泵仅存在于质膜上［16］。

质体内的钙泵于1994年被黄（Huang L.Q.）等确定，它被证实与哺乳动物P 型Ca2+ATP 酶具有同源性［17］。叶绿体上的钙泵主要发现存在于内膜上（1993—1994）。叶绿体上的钙泵被认为可能在叶绿体基质和细胞质之间的信号传导中起作用，以及与叶绿体内的代谢和蛋白质进入叶绿体基质等有关［18］。

植物中钙泵的类型在20世纪90年代下半期被鉴定出来，科学家发现，植物质膜钙泵的单体普遍小于哺乳动物的单体［17］。但他们也属于P-型ATP 酶家族［18］。植物质膜钙泵的主要功能被认为就是维持胞浆Ca2+的低浓度水平，此外，还有细胞内信号传导、分泌、气孔等调节的功能，也与有丝分裂、向地性、向光性等相关。科学家还发现，尽管不同类型的钙泵作用不同，但都参与细胞中第2 信使的活动，并与蛋白质的活性稳定和维持、细胞的分泌和生长等密切相关。

总之，从荣格的发现到今天，对钙在细胞内作用的探讨已经走过漫长的道路，20世纪60年代钙泵的发现揭开了这项研究新的一页，20世纪90年代至21世纪初又获得一系列重要的进展。对上述的要点简要归纳为图2和图3。

图2 钙泵发现的历史背景

图3 钙泵发现中的重要事件

综上所述，钙泵发现的历史顺序是沿着肌质网钙泵—动物细胞质膜钙泵—植物细胞钙泵的进程，它们之间既相对独立又相互影响。与钠钾泵研究相比，钙泵研究相对滞后，例如钙离子的跨膜传输过程及钙泵在信号传导和细胞凋亡中的分子机制等现在仍不完全清楚。钙泵研究的重要性不亚于其他离子泵，它的突破性进展需要引起进一步的关注。钙泵的作用广泛而重要，尤其是在钙行使第2 信使功能时起着非常重要的作用，被认为是生命和死亡的信号。正如著名的生理学家洛维（Otto Loewi 1873—1961，1936年诺贝尔生理学获奖者）生前预言：是的，钙是一切！