不同途径感染小鼠诺如病毒对小鼠抗体水平和病毒复制的影响

罗银珠, 张 钰, 袁 文, 何丽芳, 黄碧洪, 吴瑞可, 闵凡贵, 王 静, 潘金春, 黄 韧

(广东省实验动物监测所, 广东省实验动物重点实验室, 广州 510663)

诺如病毒(Norovirus，NoV)属于杯状病毒科，诺如病毒属, 单股正链 RNA 病毒，是目前世界上引起非细菌性急性胃肠炎暴发的主要病原[1,2]，主要经粪-口途径传播、也可以经呼吸道传播，具有较强的环境稳定性、灭活耐受性和低感染量等特点[3]。小鼠诺如病毒(murine norovirus，MNV)是目前NoV中第一个也是唯一一个有成熟体外增殖系统的病毒[4]，以替代病毒角色常被用于研究人诺如病毒 (HuNoV)[2,5]。MNV最早于2003年分离[6],目前只在鼠类动物体内发现，几乎所有实验小鼠对此病毒易感，被认为是实验鼠最常见最流行的传染病。各国报道的鼠群MNV阳性率有: 巴西38.16%(2016年, 137/359)[7]、日本13.1%(2012年,33/245)[8]、韩国 15%(2011 年, 112/745)[9]、西欧31.81%(2009年)[10]等。MNV能引起免疫缺陷鼠多系统炎症及死亡[1,6]，增强某些病原微生物致病力[11-13]。国外某些机构和组织[2]已经明确，在引进小鼠时将MNV作为筛查的病原之一。目前对MNV的研究多集中于检测方法、流行病学、灭活技术方面，然而人们尚未完全掌握其流行病学，对MNV的感染机制、感染动物模型及对实验的影响等认识有限，特别是有关不同途径感染的动物模型差异的报告非常少。因此，本研究选用免疫功能正常且常用小鼠品系ICR，经不同途径接种建立MNV感染模型，以血清抗体和组织核酸检测为指标进行跟踪和分析，全面地观测小鼠不同途径感染MNV差异，为研究MNV致病性及病毒监测提供更全面实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和细胞株 MNV Guangzhou/K162/09/CHN 毒株[14]由本实验室分离保存。小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)购自于美国典型菌种保藏中心(ATCC)。

1.1.2 实验动物 3周龄SPF级雄性ICR小鼠48只,体质量15～18 g，购自北京维通利华实验动物科技有限公司 [SCXK(京)2012-0001)，饲养于广东省实验动物监测所二级生物安全感染实验室内[SYXK(粤)2012-0122]，实行光照/黑暗各12 h昼夜循环，自由进食，动物实验开展经广东省实验动物监测所动物使用和管理委员会审批(I-IACUC2015003)。实验前，随机剖杀3只动物经酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测确定为MNV抗原抗体阴性。

1.1.3 主要试剂和仪器 qRT-PCR仪ABI 7500购自美国Applied Biosystems公司, 酶标仪Thermo MμLtiskan GO 购自Thermo Fisher Scientific公司，ELISA抗体检测试剂盒购自美国Express Bio公司，DMEM培养液购自美国Gibco公司，RNA提取试剂TRizol购自美国Invitrogen公司, DNA聚合酶购自大连宝生物公司, 其余试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 病毒培养与测定 将MNV接种到95%的RAW264.7-ATCC细胞，吸附作用1 h后加入无血清的DMEM维持液，放入37 ℃ 体积分数5% CO2细胞培养箱中培养，倒置生物显微镜观察细胞形态，90%细胞脱落后收获病毒液，反复冻融3次，并进行qRT-PCR测定病毒核酸Ct值。本实验利用以上病毒液进行了5次动物回归试验获得鼠源胃肠适应株(以胃肠感染方式适应小鼠，5次回归结果盲肠内容物病毒含量呈上升趋势)。

1.2.2 动物处理 接种动物: 取浓度约为4×104拷贝/μL的MNV鼠源胃肠适应株病毒液，利用腹腔、静脉联合注射(iv+ip), 各0.1 mL/只、饮水方法(dw),体积分数0.4%、灌胃(ig,0.2 mL/只)各接种15只3周龄ICR小鼠。动物接种病毒后，观察51 d。每日观察动物的皮毛、外观、行为及排便等情况。并于感染前(0 d), 感染后3 d、6 d、14 d、25 d、34 d、51 d剖检小鼠(各2～3只)，收集样本(心、肝、脾、肺、肾、脑、胃肠内容物)及血清，应用qRT-PCR方法检测样本病毒核酸，ELISA方法检测血清抗体水平。

1.2.3 各样本病毒核酸检测 称量约0.1 g样本, 加入600 μL的PBS缓冲液于组织研磨机上研磨3～5 min,匀浆。研磨后, 10 000 r/min离心10 min, 取200 μL上清抽提总RNA，反转录成cDNA，具体步骤参照核酸提取试剂盒(日本Takara)说明书。最后应用ABI 7500 Real-Time PCR System, Taqman RT-PCR两步法试剂盒(Takara)即 95 ℃ 30 s, 95℃ 5 s, 60 ℃30 s, 40个循坏，荧光信号采集设于60 ℃，熔解曲线设置为: 95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，50 ℃ 30 s，进行检测鉴定。所用MNV引物参照参考文献[15]，引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

1.2.4 检测血清抗体(ELISA) 根据试剂盒说明进行操作: 将血清样本1∶50稀释, 再向ELISA 微孔板各加100 μL稀释好的样本; 37 ℃孵育后洗板，每孔加100 μL酶标二抗, 37 ℃孵育后洗板，加显色液; 反应完毕用酶标仪读数，测试波长为405 nm。结果判定方法参照试剂盒说明书。

1.2.5 数据处理及统计分析 实验结束，所有数据采用SPSS 22.0软件和GraphPad Prism 5.0进行数据处理及分析。

2 结果

2.1 临床观察

3种途径接种的ICR小鼠均表现为隐性感染，无明显临床表征。

2.2 感染鼠血清抗体

不同途径接种的ICR小鼠在接种后25 d检测到MNV抗体，各组抗体水平随着感染时间迁移而升高(图1)。其中以iv+ip组抗体上升幅度最高。dw组与ig组抗体滴度变化趋势相近，即抗体水平呈小幅度上升且在51 d均低于iv+ip组。为便于计算，抗体滴度用Log2的指数表示。

2.3 组织核酸变化

3种途径接种的小鼠，均能在盲肠内容物、脾和脑中检测到病毒核酸，其中盲肠内容物的病毒载量最高。

图1 接种小鼠抗MNV血清抗体的测定(n=2～3)Figure 1 Determination of serum antibody against MNV of ICR mice infected (n=2～3)

感染后6 d (6 dpi)同时成为MNV在3种途径接种鼠的盲肠内容物增殖的时间峰点(图2A)，其中以iv+ip组病毒载量最高。直至51 d仍能从三组不同感染鼠盲肠内容物中检测到病原核酸(图2B)。MNV在胃内容物的增殖时间峰点比较，ig组出现最早(6 d), 其他2组 (dw组和iv+ip组)延后至14 d出现，前者呈一过性增殖，后者在感染后34 d 仍能够检测到病毒核酸(图2C)。MNV可在多组织上增殖，脾、脑和肝均检测出病毒核酸(图3)。在6 dpi(图3A), 以iv+ip组小鼠的脾和肝病毒载量最高,其次为ig组的脾和脑。心、肾和肺(未提供数据)检测到极少量或未检测到病毒核酸。

3 讨论

图2 MNV在各组感染鼠的胃肠内容物中的病毒载量 (n=2～3/时间点)Figure 2 MNV RNA burden in cecum and gastric contents of each infected group (n=2～3 per time)

我国对实验动物感染MNV的调查最早见于2010年[15]，后来陆续有报道[16-21]，感染率高达42.2%(139/329)，成为威胁小鼠的高危险病原。目前国内对于MNV的研究报道多集中于流行病学和检测方法, 在感染模型上研究报道鲜见。基于MNV在实验小鼠中主要通过污染水源、饲料和笼器具等流行的特点, 本实验设立dw、ig及iv+ip三种不同接种途径并结合长时间多点监测不同接种途径下该病毒在感染动物体内复制、扩散情况。

本实验分别采用分子生物学和血清学方法进行检测跟踪，结果显示感染后3 d各感染组动物均从盲肠内容物中检测到高拷贝量病毒核酸,这与以往报道的动物实验相吻合，证实了粪便是MNV重要传播途径。本实验显示, iv+ip接种组盲肠内容物病毒载量高于其它两种接种组,说明该途径感染效果较好，可作为MNV病毒感染模型的有效接种方式。采用ELISA血清检测结果显示，用本实验室临床分离毒接种3 周龄ICR小鼠, 最早在感染后25 d才检测出特异性抗体的存在，比文献[22]报道同样感染ICR 1周后即检出阳性抗体延迟了2周多，这可能与动物周龄或毒株差异及感染剂量等因素有关，这提示针对不同地方的流行株，如用ICR做哨兵鼠，MNV感染存在延后可能，建议尽早开始使用分子生物学检测以利于该病防控。病原监测计划建议血清抗体ELISA检测结合盲肠内容物核酸检测更有利于MNV早期监测。

图3 MNV在各组感染鼠的组织脏器中的病毒载量 (n=2～3/时间点)Figure 3 MNV RNA burden in organ tissue of each infected group (n=2～3 per time)

为深入了解感染途径对MNV在小鼠体内的复制及感染的影响，我们对小鼠感染后各组织多时间点进行检测跟踪，各感染途径的感染鼠盲肠内容物均检测到病毒且时间维持7周以上，表明病毒可在肠道内增值并长时间存在，这与以往动物实验结果及小鼠检测结果吻合。本实验通过胃肠黏膜途径感染的小鼠(ig组和dw组)在感染后于脾和脑检测到病毒核酸，呈现慢性组织感染,说明该病毒能突破胃肠黏膜屏障进入体内, 甚至能突破血脑屏障, 在脑内增殖。脾和盲肠淋巴结是大多文献报道小鼠感染MNV后病毒主要增殖的器官，而在脑中检测到MNV的报道较少[22,23], 集中在免疫缺陷鼠[6]及复杂性状遗传CC小鼠[24]。这可能与病毒毒株、感染途径或剂量、免疫状态、动物遗传背景等不同所致。

为进一步比较感染途径对特异性抗体产生的影响，对感染鼠进行7周多的血清监测，3种感染途径最早可检测时间均为感染后25 d，提示对于以血清学为主要监测手段的设施，动物在暴露病原后3～4周容易成为病毒传播的时间窗口，鉴于该病毒在设施环境中顽固存在和难以消灭，动物生产和使用单位在该病原清除计划上，对新引进动物最好结合分子生物学检测手段双重把关，尽可能尽早发现及时处理，杜绝病毒的引入和扩散。各接种组抗体滴度比较，抗体产生初期ig组平均抗体滴度检出最高(1∶800)，dw组其次(1∶400)，iv+ip组最低(1∶150)。这反映出胃肠黏膜在首次接触病原引起机体体液免疫反应程度最强烈。而在随后各组感染鼠抗体滴度逐渐上升过程中，iv+ip组上升幅度大，滴度最高，51 d到达1∶6 400，而其他2组在1∶3 600。这提示非黏膜途径接触MNV抗原在后期将会获得更好抗体保护水平，这可为HuNoV疫苗免疫途径提供参考。

综上所述，实验小鼠感染MNV对某些实验结果产生影响或偏倚的证据可能会越来越多。随粪便长期排毒、无症状带毒、难以被发觉和消除，或许可以解释当下MNV在鼠群中流行，感染率一直居高不下的原因。本实验以3种途径给免疫功能正常的ICR 小鼠接种MNV，小鼠均表现为无症状的带毒者且排毒时间长，此特性能导致病毒容易逃脱兽医的监视而污染设施，给实验鼠特别是种群繁殖鼠的健康监测增加难度。这也提醒设施管理者，需要提高防控意识，发现阳性动物，果断处理和淘汰，彻底根除污染源。

(致谢: 感谢本所的练月晓在病毒培养实验中所做的工作。)