不同浓度四氯化碳诱导小鼠肝纤维化模型的比较

孙家昌, 孙妩弋, 厉歆然, 彭文婷, 杜佳佳, 魏 伟

(安徽医科大学临床药理研究所, 抗炎免疫药物教育部重点实验室,抗炎免疫药物安徽省协同创新中心, 合肥 230032)

肝纤维化是各种肝损伤持续存在、组织发生修复反应时因细胞外基质合成、降解与沉积不平衡而引起的病理过程，如果损伤因素长期存在，将增加发展为肝硬化甚至肝癌的可能性，对人类健康的威胁较大。针对肝纤维化发病机制以及药物治疗的研究一直是近年研究的热点，建立稳定可靠的肝纤维化模型是进行后续研究的前提，对科研进展至关重要。近年来关于肝纤维化小鼠模型建立的报道较少，因此，本研究比较了不同浓度四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)诱导小鼠肝纤维化模型的方法，以期探求更加优化的造模方式。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取6～8周龄清洁级雄性C57BL/6J小鼠60只,体质量(18±2) g, 由安徽医科大学实验动物中心[SCXK(皖)2014-001]提供。饲养温度 18～22 ℃, 相对湿度40%～70%, 明暗循环12 h∶12 h[SYXK(皖)2014-006], 自由饮食。60只小鼠随机分为5 mL/kg体积分数10% CCl4给药组、1 mL/kg体积分数20%CCl4给药组和正常对照组。

1.2 主要试剂与仪器

抗Ⅰ、Ⅲ型胶原抗体(美国 Santa Cruz公司);抗β-actin抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司);CCl4(上海凌峰化工有限公司); 玉米油(嘉里粮油有限公司); 丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。多功能酶标仪Infinite M1000 PRO(瑞士Tecan公司)，正置显微镜BX53(日本Olympus光学株氏会社)，电泳仪(美国Bio-Rad公司)，化学发光成像分析仪(美国GE公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 模型建立及处理 小鼠适应性饲养1周，动物体征状态恢复稳定后，用玉米油分别配制体积分数10%或体积分数20% CCl4油溶液，分别腹腔注射体积分数10% CCl4油溶液(5 mL/kg)或体积分数20% CCl4油溶液(1 mL/kg)，每周2次，连续8周，两组对照组小鼠分别腹腔注射等量的油溶液。分别在造模2周、4周、6周、8周结束后, 眼眶后静脉丛取血处死小鼠，3 000 r/min离心后收集血清，于-80 ℃冰箱冻存待测。

1.3.2 肝组织病理学检查 取部分肝脏右叶，用体积分数10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片后HE和Masson染色，中性树脂封固后于显微镜下观察肝脏病理变化。

1.3.3 血清转氨酶水平的检测 按照试剂盒说明书,检测小鼠血清中的ALT、AST水平。

1.3.4 肝匀浆的制备及MDA、SOD、GSH的测定处死小鼠后，立即取出肝脏，称取50 mg肝组织，用预冷的生理盐水洗去浮血，用生理盐水研磨成10%的肝匀浆, 检测肝组织匀浆中的MDA、GSH、SOD水平，具体操作步骤依照说明书。

1.3.5 Western blotting检测肝脏I、III型胶原的表达 提取肝组织总蛋白, 进行标准蛋白定量。上样后进行10% SDS-PAGE电泳, 后转移至PVDF膜，使用质量分数5%的脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，分别孵育I、III型胶原一抗 (1∶500 稀释)和β-actin一抗 (1∶1 000 稀释)，4 ℃过夜后，用TBST洗8 min×3次， 加入相应的二抗 (1∶20 000 稀释),室温孵育2 h，TBST洗8 min ×3 次。PBS洗8 min，化学发光成像分析仪扫膜采集图像，定影。Image J 软件分析目的蛋白条带灰度值。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠体征状况

正常对照组小鼠活动频繁，反应机敏，毛色有光泽。CCl4模型组小鼠随造模时间的延长，毛色灰暗、粗糙、无光泽，反应迟钝。造模结束时，正常组和模型组小鼠均无死亡。

2.2 肝纤维化小鼠肝脏病理学变化

分别给予体积分数10% CCl4(5 mL/kg)和体积分数20% CCl4(1 mL/kg)两种不同浓度造模，观察造模2周、4周、8周时小鼠肝脏的病理变化(HE染色见图1，Masson染色见图2)。由图可见，正常组肝细胞排列整齐，肝索呈放射状，肝小叶和汇管区形态结构完整，无炎细胞浸润。2周时，肝细胞肿大，排列紊乱，出现炎细胞浸润; 另外体积分数10% CCl4(5 mL/kg)剂量组出现少量纤维组织增生, 从Masson染色看, 在中央静脉区附近产生了一些胶原。4周时, 炎性细胞浸润更加严重, 胶原生成增加, 纤维增生增多, 体积分数10% CCl4(5 mL/kg)剂量组纤维增生较体积分数20% CCl4(1 mL/kg)剂量组更为严重，汇管和中央静脉区结缔组织变厚，增生的胶原纤维从汇管区延伸至小叶间，形成了不完全的间隔。8周时，肝小叶结构完全破坏，大量纤维增生从汇管区向四周延伸形成纤维隔，体积分数10% CCl4(5 mL/kg)剂量组尤为明显，增生的肝细胞被纤维间隔分隔成大小不等的假小叶，在肝脏内呈弥漫性分布。以上结果显示小鼠肝纤维化模型建立成功，且体积分数10% CCl4(5 mL/kg)剂量组较体积分数20% CCl4(1 mL/kg)剂量组成模时间短，效果好。

2.3 转氨酶指标变化

图1 小鼠肝脏组织病理学改变(HE × 100)Figure 1 Histological changes of the liver tissues in CCl4-induced liver fibrotic mouse models (HE×100)

图2 小鼠肝脏组织病理学改变 (Masson× 100)Figure 2 Histological changes of the liver tissues in CCl4-induced liver fibrotic mouse models (Masson ×100)

分别给予体积分数10% CCl4(5 mL/kg)和体积分数20% CCl4(1 mL/kg)两种不同浓度CCl4造模, 在造模2周、4周、6周和8周分别处死小鼠，与正常组比较其转氨酶变化如表1所示。随着造模时间的延长, 转氨酶ALT、AST的水平都不断升高。与正常对照组比较，体积分数10% CCl4(5 mL/kg)剂量组的ALT水平在2周时明显增高(P＜0.05), 而体积分数20% CCl4(1 mL/kg)剂量组到4周时才明显升高(P＜0.01)。从第2周起，与正常对照组比较，体积分数10% CCl4(5 mL/kg)剂量组和体积分数20%CCl4(1 mL/kg)剂量组AST水平明显升高(P＜0.05)。

表1 不同剂量CCl4诱导的肝纤维化小鼠在不同时间点对转氨酶的影响Table 1 Changes of serum ALT, AST in different dose of CCl4 induced liver fibrotic mouse models IU/L

2.4 肝匀浆MDA含量的变化

如表2所示，随着造模的进程，肝脏中MDA含量逐渐升高。相比于正常对照组，体积分数10%CCl4(5 mL/kg)剂量组在4周时MDA含量就明显升高(P＜0.05), 而体积分数 20% CCl4(1 mL/kg)组到6周MDA的含量才明显升高(P＜0.05); 在6周、8周时, 体积分数10% CCl4(5 mL/kg)剂量组相比于20%CCl4(1 mL/kg)剂量组MDA含量明显升高(P＜0.01)。

2.5 肝匀浆抗氧化指标GSH、SOD的变化

如表3所示, 随着造模的进程, 小鼠肝脏中GSH含量和SOD活性不断下降。相比于正常对照组，2周时体积分数10% CCl4(5 mL/kg)剂量组和体积分数20% CCl4(1 mL/kg)剂量组GSH含量均明显降低(P＜0.05)，在4周、6周和8周，体积分数10% CCl4(5 mL/kg)剂量组相比于体积分数20% CCl4(1 mL/kg)组肝脏中GSH含量降低更明显(P＜0.05); 与正常对照组相比, 体积分数10% CCl4(5 mL/kg)剂量组从2周开始SOD活性明显降低(P＜0.05)，而体积分数20% CCl4(1 mL/kg)剂量组从6周才开始明显降低(P＜0.01)。在4周、6周时, 体积分数10% CCl4(5 mL/kg)剂量组相比于体积分数20% CCl4(1 mL/kg)组SOD活性进一步降低(P＜0.01)。

表2 不同剂量CCl4诱导的肝纤维化小鼠在不同时间点对肝脏MDA的影响Table 2 Changes of MDA in different dose of CCl4 induced liver fibrotic mouse models nmol/mg蛋白

表3 不同剂量CCl4诱导的肝纤维化小鼠在不同时间点对GSH和SOD的影响Table 3 Changes of GSH, SOD in different dose of CCl4 induced liver fibrotic mouse models

2.6 肝纤维化小鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达变化

Western blotting法检测10% CCl4(5 mL/kg)诱导的肝纤维化小鼠造模 2周、4周、6周和8周四个不同时间点肝脏中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达量。如图3所示，随着造模时间的延长，Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原(Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ)表达量不断增加。相比于正常对照组, Ⅰ型胶原的表达量从2周开始明显增加(P＜0.01), Ⅲ型胶原表达量从4周开始明显增加(P＜0.05)。

图3 体积分数10% CCl4(5 mL/kg)诱导的肝纤维化小鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的变化Figure 3 Expression of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ in liver of 10% CCl4(5 mL/kg) induced liver fibrotic mouse models

3 讨论

肝纤维化动物模型的成功建立是研究肝纤维化疾病发病机制，寻找药物作用靶点，研发抗纤维化药物的实验基础。目前大鼠肝纤维化模型的方法已较成熟，而小鼠肝纤维化模型建立的相关报道还较少, 且已有的报道中大多存在成模率低、死亡率高、造模时间长等问题，可能与给药途径和剂量不适宜有关。小鼠模型具备操作简便、成本低、以及在进行药效学评价实验中受试药物用量少等优点, 故本研究探讨了小鼠肝纤维化模型建立的方法。查阅了国内外构建小鼠肝纤维化模型的文献，绝大部分都选择了CCl4作为诱导剂[1-4], 可能与其毒性大,成效迅速有关。参考了前人的造模方案并结合课题组前期实验，我们最终筛选出两种造模方案[5-9]，即分别腹腔注射体积分数10% CCl4油溶液(5 mL/kg)和体积分数20% CCl4油溶液(1 mL/kg)[10,11]。对于体积分数10% CCl4(5 mL/kg)剂量组, 我们侧重于低CCl4浓度、较大的注射容量的给药方式, 体积分数20% CCl4(1 mL/kg)剂量组则侧重于较高的CCl4浓度，但通过减小注射容量降低死亡率。从造模结果看, 体积分数20% CCl4(1 mL/kg)剂量组虽无小鼠死亡，但造模效果欠佳，成模较慢，而体积分数10% CCl4(5 mL/kg)剂量组也无小鼠死亡，但造模效果较好，成模时间短。

CCl4腹腔注射诱导肝纤维化模型时，可在肝内代谢生成三氯甲基自由基，诱发脂质过氧化反应，产生过氧化物，攻击脂质和蛋白质，损伤肝功能。ALT、AST是反映肝功能的基本指标; 肝匀浆中MDA的含量可反映肝脏内脂质过氧化的程度，GSH是还原性谷胱甘肽酶的产物, 能够反映酶的活性，两者都可以间接地反映出肝细胞被损伤的程度; SOD是肝脏中的还原性酶, 能够清除损伤肝细胞的氧自由基，检测它的水平可以间接反映机体清除自由基的能力。本研究表明，在造模进程中，相比于体积分数20% CCl4(1 mL/kg)剂量组, HE及Masson胶原染色结果显示体积分数10% CCl4(5 mL/kg)剂量组肝纤维化程度更加严重, 血清ALT、AST水平升高更明显, 肝脏中SOD、GSH活性明显降低, 氧化产物MDA含量明显升高，提示体积分数10% CCl4(5 mL/kg)剂量腹腔注射诱导肝纤维化形成的时间更短，效果更好。

由于肝纤维化会引起肝脏的损伤和炎性反应，导致细胞外基质的过度沉积，而肝内细胞外基质的主要成分包括 Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原[12]等，因此胶原表达变化是观察肝纤维化程度的重要指标。本实验检测结果显示，随着造模时间的延长，Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达量明显升高，提示肝纤维化模型制备成功。

综上所述，通过腹腔注射体积分数10% CCl4(5 mL/kg), 每周2次，共8周能够成功诱导小鼠肝纤维化模型的形成，且成模率稳定高效，是一种较理想的建立肝纤维化模型的方法。