响应面法优化顺丁烯二酸-β-环糊精单乙酯的制备工艺

梁倩，李咏富，龙明秀，田竹希，何杨波，石彬

（贵州省农业科学院现代农业发展研究所，贵州贵阳 550006）

环糊精是一种具有疏水性内腔的环状低聚糖，它由多个α-D-吡喃葡萄糖通过α-1,4-糖苷键首尾相连而形成的化合物[1～3]，能选择性地结合底物，可以通过超分子催化化学反应[4]。其空腔结构可提供理想的作用位点，能与一定大小和形状的疏水性客体、亲脂性物 质通过范德华力、氢键等非共价键作用力形成包合物，不同强度的范德华力形成的包合物具有多种独特的物理、化学性质。可以运用于疏水性药物、天然色素、精油等食品和医药领域。天然的β-环糊精（β-CD）是由7个α-D-吡喃葡萄糖结构单元构成的，而其水溶性有限，它们与某些疏水性客体形成的包合物的水溶性得不到改善，更容易从水溶液中析出。因此，制备亲水性β-CD衍生物可以增加β-CD在水中的溶解性、稳定性并且拓展β-CD的应用范围，例如稳定的亲水性β-CD衍生物可作为一种理想药物载体，能够对疏水性药物有增溶作用[4～6]，对天然药物具有保护和缓释作用等[7,8]。

本文以含乙烯基的β-CD为单体，通过与亲水性单体发生自由基共聚反应制备水溶性β-CD高分子聚合物，以期增大β-CD在水中的溶解性和稳定性。衍生物中含乙烯基的报道较少，现有方法在制备乙烯基β-环糊精衍生物时采用有毒化学试剂，对环境造成污染的同时也限制了乙烯基β-环糊精衍生物的应用范围[9]。

本文采用安全的低毒的方法，通过磷酸盐的催化含有乙烯基的顺丁烯二酸与β-CD进行酯化反应，制备β-CD高分子聚合物，并采用响应面BBD设计优化酯化反应的参数条件，得到最佳条件下的酯化产物，以期增大β-CD在水中的溶解性，增加对疏水性药物的水溶性，为其进一步在药物载体方面和生物活性等方面的研究奠定基础，拓展其在食品和药品行业的应用[10]。

1 材料与方法

1.1 材料

β-环糊精（分析纯）、顺丁烯二酸（分析纯）购于阿拉丁试剂有限公司；次亚磷酸钠（SPD）购于Sigma-Aldrich（USA）；甲基氢醌购于中国国药集团公司；其余试剂均为分析纯；Aglient 1260高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；傅里叶红外光谱仪（Tensor 37, BRUKER OPTICS, Germany）；MALDI-TOF 质谱仪（BIFLEX III, Bruker Daltonics Inc., USA）。

1.2 顺丁烯二酸-β-环糊精单乙酯（CDM）的制备

顺丁烯二酸-β-环糊精单乙酯（CDM）的合成反应如下所示：

CDM的制备采用半干法，将3.405 g的β-CD与顺丁烯二酸（3～7 mmol）、次亚磷酸钠（0.2～0.7 mol）、甲基氢醌0.0186 g加入耐压品中，按固液比（0.3～0.6）加入乙醇水（30%～70%）溶液，混合均匀后于恒温鼓风干燥箱内（100 ℃～120 ℃）高温下反应3.5 h时。反应完全后冷却至室温，向耐压品中加入30 mL无水乙醇，静置24 h，过滤，用无水乙醇反复洗涤滤饼至到将水分洗净，于60 ℃烘箱干燥，产物即为顺丁烯二酸-β-环糊精单乙酯（CDM）。

1.3 HPLC法测定CDM酯化率

1.3.1 HPLC测定条件

CDM酯化率的测定采用YMC-AQ-C18（250×4.6 mm）色谱柱，流动相A为0.01 mol/L乙酸水溶液，B为无水乙醇，等度洗脱，流速1.2 mL/min；检测波长210 nm；柱温 35 ℃；进样量 10 μL。

1.3.2 标准品制备和标准曲线绘制

采用内标法测定CDM酯化率，以顺丁烯二酸单乙酯为标准品，分别配置浓度为0.05，0.1，0.5，1，2，3.5 mmol/L的标准溶液，将标准溶液浓度与其峰面积进行回归处理，绘制标准曲线，得到线性方程为y=2475.1x+9.3256，γ=0.9998，线性关系良好。

1.3.3 样品制备

准确称取CDM样品0.25 g，用蒸馏水定容至25 mL，配置成浓度为100 mg/mL的样品溶液，经过0.45 μm滤膜过滤后进行HPLC分析，测定其色谱峰面积，代入标准曲线计算酯化率（%）。

1.4 响应面设计试验

基于前期预实验工作[11]，考察了CDM制备的主要因素有顺丁烯二酸用量（X1，mmol）、固液比（X2）、反应温度（X3，℃），乙醇浓度（X4，%）4个因素范围；结合中心组合 BBD法，设计上述四因素三水平的响应面优化试验，以确定CDM的最佳制备条件。试验因素水平设计如表1所示。

表1 BBD中心组合试验设计方案中的因素水平表Table 1 The coded values and corresponding actual values of the optimization parameters

1.5 CDM的结构表征

1.5.1 红外光谱

顺丁烯二酸单乙酯、β-CD和CDM红外光谱图采用傅里叶红外光谱仪进行测定。取少量样品与质量为300 mg的KBr混匀，于研钵内研磨成粉末后压片，在4000～400波数（cm-1）内扫描。

1.5.2 质谱信息

β-CD和CDM质谱信息采用MALDI-TOF质谱仪进行测定，以2,5-二羟基苯甲酸作为基质。

1.6 统计方法

使用SPSS 18.0软件对数据进行统计学分析，响应面优化试验使用Design-Expert 8.0.5b对试验数据进行多项式回归分析；使用t检验对回归系数进行统计分析，F检验对二次多项线性回归方程的显著性进行评价，回归系数R2评价模型的回归系数和实验数据的拟合度。

2 实验结果与讨论

2.1 CDM样品的高效液相色谱图

顺丁烯二酸单乙酯、CDM 的高效液相色谱图如图1所示。顺丁烯二酸单乙酯、CDM出峰时间都在4 min左右，且不重合，说明顺丁烯二酸单乙酯可以作为内标物[12～14]。

图1 顺丁烯二酸单乙酯、顺丁烯二酸-β-环糊精单乙酯的高效液相色谱图Fig.1 The HPLC chromatograms of monoethyl maleinate and CDM

2.2 顺丁烯二酸-β-环糊精单乙酯制备参数的优化

2.2.1 模型的适应性分析

通过响应面 BBD中心组合实验得到实验值与预测值如表2所示，顺丁烯二酸-β-环糊精单乙酯的酯化率分布在0.062%～36.75%范围内，运用Design-Expert 8.0.5b统计软件对数据进行多项式回归分析，确定其回归方程式，CDM 酯化率用二次多项式回归方程表示：

回归方程通过T检验、F检验，如表3所示，该模型p＜0.0001，失逆项F值为1.55，p=0.3568，说明该模型有意义，模型拟合程度好；其决定系数R2值为0.8848，接近于1，说明实验值和预测值很接近；其校正系数R2Adj值为0.7681，说明酯化率响应值的76.81%可以被该模型预测，表明该模型的拟合度比较高[15,16]。 计自主生成结果。

表2 Box-Behnken中心组合试验设计及CDM酯化率的响应值Table 2 Box-Behnken central composite experimental design setting in coded form of the independent variables (X1, X2, X3,X4) and predicted and experimental values

p值对系数交互影响进行评价，p值越小，系数之间相互影响就越有意义[15,17]，从表3可以看出，该二次多项回归方程的一次项系数X1、X2、二次项系数X12、X22、X32具有显著性差异（p＜0.05）。

表3 响应面二次回归模型及其回归系数方差分析结果Table 3 ANOVA for the effects amounts of maleic acid (X1), solid-to-liquid ratio (X2), reaction temperature (X3) and ethanol concentsolid-to-liquid ration (X4) on synthesis of CDM using predicted polynomial models

2.2.2 响应面分析

本试验的顺丁烯二酸用量（X1，mmol）、固液比（X2）、反应温度（X3，℃），乙醇浓度（X4，%）四个因素对CDM酯化率的交互影响如图2A～F所示。

如图2A 3D响应面所示，当反应温度（110 ℃）、乙醇浓度（45%）一定时，CDM酯化率随着顺丁烯二酸用量（1～5 mmol）增加而升高，随着固液比（0.3～0.45）增加而缓慢升高，随着固液比（0.45～0.6）的增加趋于平稳，当顺丁烯二酸用量与固液比分别为3和0.45时，CDM酯化率达到最佳。

如图2B 3D响应面所示，当固液比（0.45）与乙醇浓度（45%）一定时，CDM酯化率随顺丁烯二酸用量（1～5 mmol）升高而升高，随着反应温度（100～120 ℃）升高而缓慢升高。

如图2C 3D响应面所示，当固液比（0.45）与反应温度（110 ℃）一定时，CDM 酯化率随乙醇浓度（30%～45%）的升高趋于平稳，随顺丁烯二酸用量（1～5 mmol）升高而升高，当乙醇浓度为45%，顺丁烯二酸用量为3 mmol时，CDM酯化率达到最佳。

如图2D 3D响应面所示，当顺丁烯二酸用量（3 mmol）与乙醇浓度（45%）一定时，CDM 酯化率随反应温度（100～110 ℃）的升高而缓慢升高，随固液比（0.3～0.45）升高而缓慢升高，当反应温度和固液比分别为110 ℃和0.45时，CDM酯化率达到最大。

如图2E 3D响应面所示，当顺丁烯二酸用量（3 mmol）与反应温度（110 ℃）一定时，CDM 酯化率随固液比（0.3～0.45）和乙醇浓度（30%～45%）的升高而缓慢升高，当固液比和乙醇浓度分别为 0.45和45%时，CDM酯化率达到最大。

如图2F 3D响应面所示，当顺丁烯二酸用量（3 mmol）与固液比（0.45）一定时，CDM 酯化率随乙醇浓度（30%～45%）和反应温度（100～110 ℃）的升高而缓慢升高，当乙醇浓度和固液比分别为 45%和110 ℃时，CDM酯化率达到最大。

2.2.3 验证实验

图2 3D响应面及等值图Fig.2 Response surface (3D) and Contour plots showing the effect of amounts of maleic acid (X1), solid-to-liquid ratio (X2),reaction temperature (X3) and ethanol concen-tsolid-to-liquid ration (X4) on synthesis of CDM.

为了验证模型方程的可靠性，根据响应面优化的条件进行验证实验：顺丁烯二酸用量 4.3273 mmol，固液比 0.4085，反应温度 109.462 ℃，乙醇浓度48.213%，为了实验的可操作性，将其进行修正。验证试验（n=3）结果如表4所示，实际测得CDM酯化率为40.977±2.032%，这与理论预测值40.71%接近（相对误差0.656%）。因此，采用BBD中心组合试验设计优化得到的工艺参数，准确可靠，具有意义。

表4 模型验证实验结果Table 4 Comparison between the predicted value and observed value for the response variables

2.3 CDM的结构表征

2.3.1 红外光谱分析

图3 顺丁烯二酸单乙酯、β-环糊精及顺丁烯二酸-β-环糊精单乙酯（CDM）红外光谱图Fig.3 The FT-IR sepctra of monoethyl maleinate, β-cyclodextrin and CDM

顺丁烯二酸单乙酯、β-CD以及CDM的红外光谱[18,19]比较图如图3所示β-CD吸收峰：在950 cm-1处是环糊精糖苷键骨架振动吸收峰，1044 cm-1是C-O/C-C拉伸震动吸收峰，1205 cm-1处吸收峰属于O-H平面弯曲振动，1160 cm-1C-O-C拉伸/O-H弯曲振动吸收峰，1250～1370附近吸收峰属于C-H的弯曲振动，1465 cm-1处CH2弯曲振动吸收峰；顺丁烯二酸单乙酯中不饱和酯键吸收峰有：1722 cm-1处C=O伸缩振动吸收峰，1708 cm-1处羧酸C=O伸缩振动吸收峰，CDM保留了β-环糊精的固有吸收峰，在1722 cm-1和1708 cm-1处不饱和酯键吸收峰与顺丁烯二酸一致，在1637 cm-1处是C=C双键伸缩振动吸收峰。由此说明了顺丁烯二酸-β-环糊精单乙酯（CDM）的合成[20]。

2.3.2 质谱分析

对β-CD及CDM进行了质谱分析[21,22]，质谱信息如图 4所示，[CDM+Na]+质荷比(m/z)为 1255.6，[β-CD+Na]+质荷比(m/z)为1157.6，顺丁烯二酸的相对分子质量为116.07，也就是说CDM失去一个水分子（相对分子质量18）与顺丁烯二酸中的一个羧基发生酯化反应，形成CDM，CDM结构如图5所示。

图4 CDM的质谱图Fig.4 The mass spectra of CDM

图5 CDM结构图Fig.5 The molecular structure of CDM

3 结论

本文采用Design-Expert 8.0.5b软件，以BBD中心设计法优化顺丁烯二酸-β-环糊精单乙酯（CDM）合成条件，优化得到的工艺参数为顺丁烯二酸用量4.327 mmol，固液比0.408，反应温度109.462 ℃，乙醇浓度48.213%，CDM酯化率预测值为40.71%，在最佳工艺参数下，CDM实际酯化率达到40.977±2.032%，与预测值接近（相对误差 0.656%）说明采用响应面BBD中心组合试验设计优化得到CDM合成参数准确可靠；通过对样品进行红外光谱和质谱表征，佐证了顺丁烯二酸-β-环糊精单乙酯的合成。

顺丁烯二酸-β-环糊精单乙酯（CDM）制备工艺的优化，为进一步研究CDM单体的活性以及相关实验奠定了基础，为其在药物和食品方面的开发应用提供了参考。